候选HTT效应子筛选与毒力验证
从HTT特异性表达的候选效应子中鉴定参与毒力和肥大肿瘤形成的效应子。
选取10个HTT特异性候选基因，排除已知功能或缺乏信号肽的候选，对剩余6个用CRISPR-Cas9在SG200中构建移码敲除突变体，进行玉米幼苗感染并评估肿瘤形成，对毒力降低的突变体进行基因互补验证。
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玉米黑粉菌破坏碳水化合物信号网络以诱导宿主细胞肥大
Ustilago maydis disrupts carbohydrate signaling networks to induce hypertrophy in host cells.
实验完整度
高整合CRISPR-Cas9突变体、转录组、磷酸化蛋白质组、蛋白质互作及玉米感染模型多层级功能与机制验证
主要模型
玉米（Zea mays）幼苗感染模型 玉米黑粉菌（Ustilago maydis）SG200菌株及CRISPR-Cas9突变体 本氏烟草（N. benthamiana）瞬时表达体系
重点核对
玉米幼苗7日龄接种U. maydis，OD600=1用于病害评分、OD600=3用于显微观察/组学/RNA-seq 病害评分在接种后12天（12 dpi）进行，采用0-9级评分标准，三次独立生物学重复 RNA-seq取接种后3 dpi叶片，三次独立生物学重复，Illumina NovaSeq 6000 150-bp双端测序 磷酸化蛋白质组取3 dpi叶片，三次生物学重复，TiO2富集磷酸肽 SnRK1活性检测通过共表达rACC1-GFP与ZmSnRK1α2及Hap1，Western blot检测rACC1 Ser79磷酸化
摘要
玉米黑粉菌（Ustilago maydis）侵染玉米会引起肥大性叶瘤；然而，驱动这种过度细胞生长的潜在机制尚不清楚。在本研究中，我们鉴定出Hap1（肥大相关蛋白1）是一个调控叶肉细胞肥大的效应子和毒力因子。利用CRISPR-Cas9诱变，我们证明Hap1参与感染组织中的内复制和淀粉积累。转录组学揭示Hap1依赖性地上调淀粉生物合成和细胞周期基因，并抑制植物防御。这将Hap1与代谢和细胞周期重编程以及免疫抑制联系起来。为了鉴定驱动代谢重编程的Hap1靶标，我们研究了其与玉米ZmSnRK1α的相互作用。我们发现Hap1干扰SnRK1底物的磷酸化，并且两个Hap1相互作用效应子Hip1和Hip2增强其蛋白稳定性。我们得出结论：Hap1通过调节SnRK1信号通路来调控淀粉生物合成和宿主防御反应，从而参与玉米代谢和细胞周期的重编程以及叶肉细胞肥大。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 玉米黑粉菌侵染诱导玉米叶肉细胞肥大的分子机制，特别是参与肥大性肿瘤（HTT）形成的效应子及其宿主靶标是什么。
- 核心机制
- Hap1效应子与玉米SnRK1α催化亚基互作，抑制SnRK1依赖性底物磷酸化，从而解除SnRK1对淀粉合成的抑制并抑制防御反应，同时Hip1和Hip2增强Hap1稳定性并影响其与SnRK1α的互作。
- 主要证据
- CR-hap1突变体降低毒力、减少内复制和淀粉积累；转录组显示Hap1依赖上调淀粉合成和细胞周期基因、抑制防御；IP-MS和Split-luc/Co-IP验证Hap1与ZmSnRK1α2及Hip1/Hip2互作；磷酸化蛋白质组和SnRK1活性 assay显示Hap1抑制SnRK1底物磷酸化。
- 研究意义
- 揭示了病原菌效应子介导宿主代谢重编程以促进肿瘤发育的机制，将Hap1-SnRK1轴与病原诱导的肿瘤形成、代谢重编程和免疫抑制联系起来。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Hap1调控内复制和淀粉积累的组织学验证
验证Hap1是否促进叶肉细胞内复制和淀粉积累。
用mock、SG200、CR-hap1和CR-sts2菌株感染玉米幼苗，6 dpi取叶片横切，PI染色测量叶肉细胞核大小，Lugol碘液（IKI）染色观察淀粉分布并定量。
Hap1依赖的宿主转录组分析
解析Hap1在感染期间调控的宿主转录反应，特别是与内复制和淀粉积累相关的基因。
对mock、SG200和CR-hap1感染的玉米幼苗3 dpi叶片进行RNA-seq，鉴定差异表达基因，进行GO富集分析，重点关注细胞周期和淀粉生物合成基因。
Hap1宿主靶标的鉴定与互作验证
鉴定Hap1在玉米中的宿主靶蛋白并验证其互作。
用表达Hap1-2xHA的U. maydis菌株感染玉米，3 dpi取叶片进行HA免疫沉淀和质谱鉴定；用Split-luciferase互补实验和Co-IP在本氏烟草中验证Hap1与ZmSnRK1α1/2/3的互作。
Hap1与Hip1/Hip2互作及功能分析
验证Hap1与U. maydis效应子Hip1/Hip2的互作，并分析Hip1/Hip2对Hap1稳定性及Hap1-SnRK1α互作的影响。
通过IP-MS、Split-luc和Co-IP验证Hap1-Hip1、Hap1-Hip2、Hip1-Hip2互作；构建hip1/hip2单突变和双突变体在Hap1-HA背景下进行IP-MS，分析Hap1互作组变化；在本氏烟草中共表达Hap1与Hip1/Hip2，Western blot检测Hap1蛋白积累。
Hap1对宿主磷酸化信号和SnRK1活性的影响
解析Hap1对宿主磷酸化蛋白质组的影响，并验证Hap1对SnRK1激酶活性的抑制作用。
对mock、SG200和CR-hap1感染的玉米3 dpi叶片进行定量磷酸化蛋白质组分析，鉴定Hap1依赖的磷酸化变化；用rACC1-GFP报告系统在本氏烟草中检测Hap1对ZmSnRK1α2磷酸化rACC1 Ser79的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 菌株培养 | dYT液体培养基 | -- | -- |
| YEPSLight液体培养基 | -- | -- | |
| 淀粉染色 | 卢戈氏碘液 | Roth | -- |
| 细胞核染色 | 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Turbo DNA-Free™试剂盒 | Ambion Life Technologies™ | -- | |
| 蛋白质提取 | cOmplete™蛋白酶抑制剂 | Roche | -- |
| 免疫共沉淀 | 抗Myc磁珠 | ChromoTek | -- |
| 抗GFP磁珠 | ChromoTek | -- | |
| Western blot | 抗GFP抗体 | Roche | 11814460001 |
| 抗Myc抗体 | Invitrogen | R951-25 | |
| 抗HA抗体 | Sigma-Aldrich | 12158167001 | |
| 磷酸化蛋白质组 | 磷酸酶抑制剂 | Sigma | P5726-5ML |
| 磷酸酶抑制剂 | Sigma | P0044-5ML | |
| 蛋白质消化 | 赖氨酸C端蛋白酶 | WAKO | -- |
| 磷酸肽富集 | Titansphere TiO2（10微米） | GL Science Inc, Japan | 5020-75010 |
| Protein LoBind 96孔板 | Eppendorf | 0030504100 | |
| SnRK1活性检测 | 磷酸化乙酰辅酶A羧化酶（Ser79）抗体 | CST | 3661 |
| Split-luciferase检测 | D-荧光素 | Promega | -- |
| 化学发光检测 | ChemiDoc MP成像仪 | Bio-Rad | -- |
| 显微镜成像 | Nikon Eclipse Ti倒置显微镜 | Nikon | -- |
| 共聚焦成像 | 共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | TCS SP8 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 玉米幼苗感染与病害评分 | 玉米品种（Golden Bantam或Early Golden Bantam）、7日龄幼苗、接种浓度OD600=1（病害评分）或OD600=3（显微/组学）、12 dpi病害评分、三次独立生物学重复 阅读提示：Methods中'Maize infection, and disease scoring'小节及Supplementary Fig. 13评分标准 |
| 组织学染色与核大小定量 | 6 dpi取样、叶片横切13 µm、PI和IKI染色、三次独立生物学重复（mock两次）、每个样品>55个细胞核 阅读提示：Methods中'Leaf staining, tissue embedding, sectioning and microscopy'小节及Fig. 1图注 |
| RNA-seq | 3 dpi取样、三次独立生物学重复、Illumina NovaSeq 6000 150-bp双端测序、差异表达基因阈值（Log2FC>1或<-1且FDR<0.05） 阅读提示：Methods中'RNA preparation and RNA-Seq analysis'小节及Fig. 2图注 |
| IP-MS鉴定Hap1互作蛋白 | 3 dpi取样、每个生物学重复至少10片叶、三次独立生物学重复、HA磁珠免疫沉淀、对照菌株SG200-pPit2::SP-mCherry-HA 阅读提示：Methods中'Co-immunoprecipitation (Co-IP) in maize and sample preparation'小节及Fig. 3b图注 |
| 磷酸化蛋白质组 | 3 dpi取样、三次生物学重复、TiO2富集磷酸肽、磷酸化肽段Log2FC≥1或≤-1阈值、总蛋白质组与磷酸化蛋白质组整合分析 阅读提示：Methods中'Sample preparation for total proteome and phosphoproteome'小节及Fig. 7a图注 |
| SnRK1活性检测 | rACC1-GFP与ZmSnRK1α2及Hap1共表达、抗P-S79 ACC抗体（CST #3661，1:1000）、三次生物学重复（每次来自三株植物叶片pool）、ImageJ定量、配对t检验 阅读提示：Methods中'SnRK1 activity assay'小节及Fig. 7f、g图注 |