建立多西他赛耐药PDX模型
在体内模拟前列腺癌对多西他赛的初始响应和复发耐药
将LuCaP35CR和LuCaP70CR PDX移植到去势雄性scid小鼠，待肿瘤达500 mm3后给予多西他赛30 mg/kg腹腔注射每21天，直至肿瘤达约1500-2000 mm3，末次给药后2周 harvest 耐药肿瘤，并与未治疗对照肿瘤进行RNA-seq和LP-WGS。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
FOXJ1通过调控微管动力学介导紫杉烷耐药
FOXJ1 mediates taxane resistance through regulation of microtubule dynamics.
实验完整度
高包含PDX体内模型、细胞系体外功能验证、机制探究及临床队列分析
主要模型
LuCaP35CR和LuCaP70CR去势抵抗性前列腺癌PDX模型 LNCaP和DU145前列腺癌细胞系 LNCaP皮下异种移植瘤模型 CHAARTED临床试验患者队列
重点核对
PDX模型：LuCaP35CR和LuCaP70CR在去势雄性scid小鼠中皮下移植，多西他赛30 mg/kg腹腔注射每21天一次 LNCaP异种移植：FOXJ1_OE或EV细胞皮下接种裸鼠，肿瘤达500 mm3后多西他赛30 mg/kg腹腔注射 FOXJ1敲低：使用shRNA-01、shRNA-02（LNCaP）或shRNA-01、shRNA-02、shRNA-03（DU145） 多西他赛体外处理浓度和时间：如10 nM或50 nM处理24小时（具体实验不同） Flutax-2结合实验：1 µM FITC-conjugated paclitaxel处理5分钟，洗脱后时间-lapse成像
摘要
多西他赛是转移性前列腺癌（PC）的一线化疗药物，但具有临床意义的耐药机制仍有待确立。在此，我们在多西他赛耐药PC患者来源异种移植（PDX）的体内模型中显示，驱动多纤毛细胞发育的基因表达增加，包括FOXJ1及其效应基因，其中许多调控微管（MTs）。机制上，FOXJ1过表达在体外和体内赋予多西他赛耐药，这与多西他赛介导的MT成束减少相关。过表达一个MT相关的FOXJ1调控基因（TPPP3）具有类似效应。相反，FOXJ1敲低损害基础MT功能，增强紫杉烷与MTs的结合，并增加多西他赛敏感性。这些结果确立了FOXJ1信号轴、MT生物学和紫杉烷耐药之间的机制因果关系。临床上，FOXJ1基因扩增在紫杉烷治疗的PC患者中增加。此外，在多西他赛联合雄激素剥夺治疗转移性PC的CHAARTED临床试验中，较高的基线FOXJ1预测多西他赛治疗的PC患者生存期缩短，进一步支持临床相关性。总之，这些发现确定了一种先前未被认识的、具有临床影响的紫杉烷耐药机制，其利用可能对不会从紫杉烷治疗中获益的患者进行分层。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 前列腺癌中紫杉烷耐药的临床相关机制是什么？
- 核心机制
- FOXJ1通过上调包括TPPP3在内的微管相关基因，改变微管动力学，减少多西他赛诱导的微管成束和药物-靶点结合，从而介导紫杉烷耐药。
- 主要证据
- 在多西他赛耐药PDX中FOXJ1表达增加；FOXJ1过表达在体外和体内降低多西他赛敏感性并减少微管成束；FOXJ1敲低增加药物结合和敏感性；TPPP3过表达部分模拟耐药；CHAARTED试验中高FOXJ1预测多西他赛获益不佳。
- 研究意义
- 识别了FOXJ1作为紫杉烷耐药的临床相关介导因子，可能用于分层不会从紫杉烷治疗中获益的患者。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证FOXJ1过表达对多西他赛敏感性的影响（体外）
确定FOXJ1过表达是否赋予多西他赛耐药并影响微管成束
建立FOXJ1稳定过表达的LNCaP细胞，通过集落形成实验、流式细胞术检测G2/M比例、pH3S10免疫印迹和微管聚合实验评估多西他赛敏感性及微管成束。
验证FOXJ1敲低对多西他赛敏感性的影响（体外）
确定内源性FOXJ1下调是否增加多西他赛敏感性及药物结合
在LNCaP和DU145中使用shRNA敲低FOXJ1，通过集落形成、流式细胞术、共聚焦显微镜和Flutax-2结合实验评估多西他赛敏感性、微管成束和药物结合。
评估FOXJ1对基础微管动力学的影响
确定FOXJ1是否调节非纤毛细胞中的基础微管动力学
在DU145 FOXJ1 KD和对照细胞中，通过乙酰化α-tubulin免疫印迹和EB1-EGFP活细胞成像分析微管生长速率、彗星长度和轨迹。
验证FOXJ1过表达体内赋予多西他赛耐药
确定FOXJ1过表达是否在体内导致多西他赛耐药
建立LNCaP FOXJ1_OE和EV皮下异种移植瘤，肿瘤达500 mm3后给予多西他赛30 mg/kg腹腔注射，监测肿瘤生长，并通过免疫荧光评估微管药物-靶点结合。
验证TPPP3在FOXJ1介导的耐药中的作用
确定TPPP3是否作为FOXJ1下游效应基因贡献于多西他赛耐药
建立TPPP3过表达LNCaP细胞，通过流式细胞术、微管聚合实验和异种移植瘤实验评估多西他赛敏感性及微管成束。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 多西他赛 | TargetMol | T1034 |
| 卡巴他赛 | TargetMol | T2543 | |
| 长春新碱 | TargetMol | T6721 | |
| 秋水仙碱 | TargetMol | T0320 | |
| 美登素 | TargetMol | T21351 | |
| 埃博霉素 | TargetMol | T6490 | |
| 奥拉帕利 | TargetMol | T3015 | |
| 顺铂 | TargetMol | T1058 | |
| 卡铂 | TargetMol | T1564 | |
| 动物实验 | 多西他赛 | SelleckChem | -- |
| 质粒构建 | pReceiver-Lv241载体 | GeneCopoeia | -- |
| shRNA | FOXJ1 shRNA-01 | Sigma-Aldrich | TCRN0000420413 |
| FOXJ1 shRNA-02 | Sigma-Aldrich | TCRN0000015305 | |
| FOXJ1 shRNA-03 | Sigma-Aldrich | TCRN0000015305 | |
| EB1-EGFP标记 | EB1-EGFP慢病毒颗粒 | VectorBuilder | VB230531-1518prn |
| 微管标记 | 微管追踪深红 | Invitrogen | T34077 |
| 免疫荧光 | 抗β-微管蛋白抗体（克隆YL1/2） | EMD Millipore | Mab1864-I |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗大鼠二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-11006 | |
| Flutax-2结合实验 | FITC标记的紫杉醇（Flutax-2） | Thermo Fisher Scientific | P22310 |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 |
| 抗Vinculin抗体 | Santa Cruz | sc-73614 | |
| 抗乙酰化α-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 5335 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Abcam | ab7291 | |
| 抗FOXJ1抗体 | R&D Systems | AF3619 | |
| 抗TPPP3抗体 | Thermo Fisher | PA5-24925 | |
| 抗磷酸化组蛋白H3（ser10）抗体 | Cell Signaling Technology | 9701 | |
| 抗CLIP-170抗体（克隆E-8） | Santa Cruz | -- | |
| 抗兔HRP偶联抗体 | Promega | W401B | |
| 抗小鼠HRP偶联抗体 | Promega | W402B | |
| 抗山羊HRP偶联抗体 | R&D systems | A15999 | |
| qPCR | TaqMan RNA-to-CT 1-Step试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| FOXJ1 Taqman探针 | Thermo Fisher | Hs00230964_m1 | |
| TPPP3 Taqman探针 | Thermo Fisher | Hs00372228_g1 | |
| GMNC Taqman探针 | Thermo Fisher | Hs04970928_m1 | |
| HES1 Taqman探针 | Thermo Fisher | Hs00172878_m1 | |
| HEY1 Taqman探针 | Thermo Fisher | Hs05047713_s1 | |
| GAPDH对照探针 | Thermo Fisher | 4326317E | |
| RNA/DNA提取 | Allprep DNA/RNA迷你试剂盒 | Qiagen | Q33238 |
| 免疫荧光 | EnVision FLEX靶标修复液（高pH） | Dako | DM828 |
| 细胞培养 | Matrigel（Corning基底膜基质） | Corning | CLS 354234 |
| 流式细胞术 | 碘化丙啶 | BioLegend | -- |
| 集落形成 | 结晶紫 | Sigma Aldrich | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PDX模型建立与多西他赛处理 | PDX模型来源（LuCaP35CR和LuCaP70CR）、宿主小鼠品系和性别（去势雄性scid小鼠）、多西他赛剂量（30 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、给药间隔（每21天）、harvest时间（末次给药后2周） 阅读提示：Methods 'Patient-derived xenograft generation and treatment'及Fig. 1A, B图注 |
| LNCaP异种移植瘤多西他赛处理 | 细胞接种量（~2×10^6）、基质胶浓度（50%）、小鼠品系（雄性裸鼠）、多西他赛剂量（30 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、给药时间点（第9天和第21天或第30天）、每组小鼠数量（6只或3只） 阅读提示：Methods 'LNCaP xenograft generation and treatment'及Fig. 5A, 6F图注 |
| FOXJ1敲低实验 | shRNA序列编号（shRNA-01: TCRN0000420413; shRNA-02和shRNA-03: TCRN0000015305）、细胞系（LNCaP和DU145）、多西他赛处理浓度和时间（如50 nM 24小时） 阅读提示：Methods 'Plasmids and cell lines'及Fig. 3图注 |
| 微管聚合实验 | 多西他赛或卡巴他赛处理浓度（过夜）、低盐缓冲液成分、离心速度和时间（15,000 rpm 5分钟）、Western blot检测α-tubulin 阅读提示：Methods 'Tubulin polymerization assay' |
| Flutax-2结合实验 | Flutax-2浓度（1 µM）、处理时间（5分钟）、洗脱后成像时间点（0, 15, 30, 60, 90分钟） 阅读提示：Methods 'Native cytoskeleton imaging'及Fig. 3I, J图注 |
| EB1-EGFP成像 | EB1-EGFP慢病毒感染复数（MOI=1）、Tubulin Tracker Deep Red浓度（1 µM）、成像帧率（每0.5秒一帧，共10秒） 阅读提示：Methods 'EB1 imaging and quantification'及Fig. 4B-G图注 |