小鼠肾移植模型建立与TCMR诱导
在可控时间点诱导急性TCMR并评估移植物功能与组织学变化
将C57BL/6或BALB/c小鼠肾脏移植到同系或同种异体受体，冷缺血60分钟，移植后第7天取材，检测血清肌酐、尿素、组织学（PAS染色）和生存。
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损伤的上皮细胞状态影响T细胞介导的排斥反应后肾移植物的存活
Injured epithelial cell states impact kidney allograft survival after T-cell-mediated rejection.
实验完整度
高小鼠肾移植模型、snRNA-seq、空间转录组学、免疫荧光、人snRNA-seq验证及大队列生存分析，含功能与机制验证
主要模型
小鼠同系与同种异体肾移植模型（C57BL/6与BALB/c组合） 人肾移植活检样本（TCMR与稳定移植物） 肾移植批量转录组队列（MMDx活检）
重点核对
小鼠肾移植冷缺血时间60分钟，移植后第7天取材 snRNA-seq使用3个同系和5个同种异体肾脏，共39706个核 空间转录组学使用2个同系和5个同种异体肾脏 人snRNA-seq使用3个TCMR和3个稳定移植物活检 批量转录组生存分析队列1061例患者，随访3年
摘要
T细胞介导的排斥反应（TCMR）尽管被认为可治疗，但仍是肾移植失败的主要原因。其影响反映了对潜在分子机制及其临床后果的理解有限。为解决这一问题，我们在小鼠肾移植中诱导了急性TCMR，并使用单核RNA测序（snRNA-seq）、空间转录组学和免疫荧光分析了分子变化。结果与来自TCMR和稳定移植物的 人snRNA-seq数据以及肾移植活检批量转录组数据的单细胞去卷积分析进行了比较。我们发现TCMR在小鼠肾移植物中诱导了损伤的上皮细胞状态，特别是在近端小管和粗升支。这些损伤上皮状态的空间转录组学显示了异质性定位、与免疫细胞的相互作用和细胞微环境。跨物种分析证实了人样本中类似的严重损伤上皮状态，其丰度与移植存活相关，并且在TCMR缓解后仍然存在。总之，我们的结果确定了上皮损伤细胞状态是TCMR后结局的决定因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TCMR诱导的分子变化及其对肾移植存活的影响是什么？
- 核心机制
- TCMR诱导近端小管和粗升支中损伤上皮细胞状态的出现，这些状态具有促炎和促纤维化特征，并与免疫细胞形成微环境，从而影响移植物存活。
- 主要证据
- 小鼠肾移植模型的snRNA-seq和空间转录组学显示损伤上皮状态；人snRNA-seq和单细胞去卷积证实类似状态；大队列批量转录组学关联损伤状态基因集评分与移植物存活。
- 研究意义
- 识别上皮损伤细胞状态作为TCMR后结局的决定因素，提示其可作为风险分层生物标志物和潜在治疗靶点，但需进一步功能研究验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
snRNA-seq与空间转录组学分析
解析TCMR诱导的分子变化和细胞状态
对同系和同种异体移植肾进行snRNA-seq和Xenium空间转录组学，鉴定细胞类型、差异基因表达和损伤细胞亚群。
损伤上皮细胞状态的空间定位与免疫细胞邻近分析
评估损伤上皮细胞状态的空间分布及其与免疫细胞的相互作用
通过标签转移将snRNA-seq亚群映射到空间数据，使用免疫荧光验证标记基因，计算免疫细胞与损伤细胞的共现概率和空间域分析。
人肾移植样本验证
验证小鼠发现的损伤上皮细胞状态在人TCMR中的存在和对应关系
对人TCMR和稳定移植物活检进行snRNA-seq，与小鼠数据跨物种比较，并使用单细胞去卷积分析批量转录组数据。
损伤细胞状态基因集与临床结局关联
评估损伤上皮细胞状态对肾移植存活的影响
生成PT和TAL损伤细胞状态的特异性标记基因集，在批量转录组队列中计算基因集评分，并与3年移植物存活关联。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠肾移植灌注 | HTK溶液（Custodiol®） | Dr. Franz Köhler Chemie GmbH | -- |
| 小鼠免疫荧光抗原修复 | 抗原修复液 | Agilent Technologies, Inc. | S1699 |
| 小鼠免疫荧光抗体稀释 | 抗体稀释液 | Agilent Technologies, Inc. | S3022 |
| 人免疫荧光脱蜡 | ROTI®Histol脱蜡液 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 6640.4 |
| 人免疫荧光抗原修复 | 柠檬酸 | Sigma-Aldrich | 1.00244.0500 |
| 人免疫荧光封片 | 含DAPI的抗淬灭封片剂 | dianova | DNA-SCR-038448 |
| 人免疫荧光抗体洗脱 | 十二烷基硫酸钠 | Carl Roth GmbH + Co. KG | CN30.2 |
| Tris-HCl缓冲液 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 9090.3 | |
| snRNA-seq组织保存 | RNA保存液 | Invitrogen | AM7020 |
| 小鼠免疫荧光 | 山羊多克隆抗KIM1抗体 | R&D Systems | AF1817 |
| 山羊多克隆抗NKCC2抗体 | Abcam | ab240542 | |
| 小鼠单克隆抗ANXA3抗体（克隆OTI1A5） | OriGene | TA502123 | |
| 小鼠单克隆抗LRP2/Megalin抗体（克隆CD7D5） | Abcam | ab184676 | |
| 兔多克隆抗ACSM3抗体 | Proteintech | 10168-2-AP | |
| 兔多克隆抗MMP7抗体 | Proteintech | 10374-2-AP | |
| 兔单克隆抗STK39抗体（克隆OD9L5） | Thermo Fisher Scientific | MA5-38038 | |
| 兔单克隆抗波形蛋白抗体（克隆EPR3776） | Abcam | ab92547 | |
| 大鼠单克隆抗CD8a抗体（克隆4SM15） | Thermo Fisher Scientific | 13-0808-82 | |
| 大鼠单克隆抗F4/80抗体（克隆A3-1） | Bio-Rad | MCA497GA | |
| 大鼠多克隆抗LRP2/Megalin抗体 | BiCell Scientific | 31012 | |
| 大鼠单克隆抗VCAM1/CD106抗体（克隆429） | Invitrogen | 14-1061-82 | |
| 人免疫荧光 | 山羊多克隆抗SLC12A1/NKCC2抗体 | Abcam | ab240542 |
| 山羊多克隆抗TIM-1/KIM-1/HAVCR抗体 | R&D Systems | AF1750 | |
| 小鼠单克隆抗ANXA3抗体（克隆OTI1A5） | OriGene | TA502123 | |
| 小鼠单克隆抗CD68抗体（克隆KP1） | Dako / Agilent | M0814 | |
| 小鼠单克隆抗VCAM-1抗体（克隆1.4C3） | Thermo Fisher Scientific | MA5-11447 | |
| 兔单克隆抗CD8α抗体（克隆SI18-01） | Thermo Fisher Scientific | MA5-32069 | |
| 兔单克隆抗STK39抗体（克隆0D9L5） | Thermo Fisher Scientific | MA5-38038 | |
| 兔多克隆抗ACSM3抗体 | Proteintech | 10168-2-AP | |
| 兔多克隆抗MMP7抗体 | Proteintech | 10374-2-AP | |
| 大鼠多克隆抗LRP2（megalin）抗体 | BiCell | 31012 | |
| 抗α平滑肌肌动蛋白抗体（克隆1A4） | Abcam | ab7817 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠肾移植模型 | 小鼠品系与性别年龄（雄性C57BL/6和BALB/c，10-12周龄）、冷缺血时间（60分钟）、移植后取材时间（第7天）、同系与同种异体组合 阅读提示：Methods 'Mouse kidney transplantation'；Fig. 1B |
| snRNA-seq与空间转录组学 | 样本数量（snRNA-seq：3同系+5同种异体；空间转录组学：2同系+5同种异体）、测序平台与试剂版本、Xenium基因面板（379基因+100定制基因） 阅读提示：Methods 'Single nucleus mRNA sequencing' 和 'Xenium in Situ Profiling'；Suppl. Data 1 |
| 人snRNA-seq样本 | 样本来源（Hannover Medical School协议活检）、TCMR与稳定移植物数量（各3例）、患者年龄性别范围（49-77岁，4男2女） 阅读提示：Methods 'Human samples snRNA-seq'；Suppl. Table S1 |
| 批量转录组生存分析 | 队列规模（1061例患者）、排斥类型分布（624无排斥，95 TCMR，45混合，297 ABMR）、随访时间（3年）、基因集评分方法（几何平均表达） 阅读提示：Methods 'Kidney transplant bulk transcriptomics cohort' 和 'Gene set scores in bulk transcriptomic data'；Fig. 8A |
| 免疫荧光验证 | 抗体克隆与货号（见Table 1和Table 2）、抗原修复条件、重复次数（三次重复结果相似） 阅读提示：Methods 'Immunofluorescence staining on mouse kidneys' 和 'Immunofluorescence staining on human kidneys'；Table 1和Table 2 |