小鼠蜕膜化模型建立与DEndo-UdECM制备
获取反映动态蜕膜化微环境的脱细胞ECM支架。
假孕小鼠D4向双侧子宫角注射芝麻油诱导蜕膜化，D8采集子宫；经Triton X-100、SDS和DNase I脱细胞，冻干粉碎得到DEndo-UdECM，并以H&E、Masson、DNA定量和IF表征。
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蜕膜化赋能ECM水凝胶整合持续Tβ4释放驱动宫腔粘连子宫内膜再生
Decidualization-empowered ECM hydrogel integrating sustained Tβ4 release drives endometrial regeneration in intrauterine adhesions.
实验完整度
高含体外细胞功能、小鼠IUA模型体内治疗、生育力评估及焦亡/TGF-β通路机制验证
主要模型
小鼠人工蜕膜化模型 小鼠95%乙醇诱导IUA模型 Ishikawa子宫内膜上皮细胞 人子宫内膜基质细胞hESC
重点核对
小鼠IUA模型采用左侧子宫腔注入50 μL 95%乙醇1 min诱导，对侧作为未损伤内对照 体内分组为Sham、Model(PBS)、Tβ4@PLGA、CEndo-UdECM、DEndo-UdECM、CEndo-UdECM/Tβ4@PLGA、DEndo-UdECM/Tβ4@PLGA，每组n=24，损伤后即刻宫腔注射30 μL 体外抗纤维化模型使用10 ng/mL TGF-β1诱导hESC，并以100 nM Tβ4处理48 h 生育力评估在术后两周与生育雄鼠交配，统计GD8植入点和GD19活产仔数，每组n=6 流式细胞术检测巨噬细胞极化，每组n=3，F4/80+门内分析CD86+与CD206+比例
摘要
宫腔粘连（IUA）是女性不孕的主要原因之一，其源于子宫损伤反应从再生向纤维化瘢痕的病理性转换。现有治疗常因无法纠正这一根本转变而效果不足。在此，我们报道一种“蜕膜化赋能”水凝胶，通过将来自蜕膜化子宫内膜的生物活性细胞外基质（DEndo-UdECM）与抗纤维化肽胸腺素β4（Tβ4）的持续释放协同结合，逆转这一病理过程。在小鼠IUA模型中，单次给药即可恢复子宫内膜结构、消退纤维化，并且最关键的是，使生育力接近完全恢复。机制上，该水凝胶通过将巨噬细胞重编程为M2表型，同时双重抑制焦亡驱动的炎症和经典TGF-β/Smad3纤维化级联，从而构建促再生微环境。总之，这些发现表明，模拟生理微环境的生物学智能可解决复杂纤维化疾病并恢复器官功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用蜕膜化子宫内膜来源的ECM构建促再生支架，并结合持续释放的抗纤维化肽Tβ4，逆转IUA的纤维化病理并恢复子宫内膜功能与生育力。
- 核心机制
- DEndo-UdECM/Tβ4@PLGA水凝胶将巨噬细胞从M1向M2表型重编程，同时抑制焦亡通路（GSDMD-NT、Pro-caspase-1、IL-1β、IL-18）和经典TGF-β/Smad3纤维化通路，并恢复子宫内膜容受性分子特征。
- 主要证据
- 体外实验显示DEndo-UdECM促进Ishikawa细胞增殖、hESC迁移和HUVEC成管，Tβ4抑制TGF-β1诱导的纤维化标志物；小鼠IUA模型中单次给药恢复子宫内膜厚度和腺体、减少胶原沉积和α-SMA/COL1表达、降低M1/M2比例，并使植入点和活产仔数接近Sham组。
- 研究意义
- 作者提出模拟生理蜕膜微环境的生物学智能可解决复杂纤维化疾病并恢复器官功能，为宫腔粘连提供不依赖细胞的再生治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DEndo-UdECM与CEndo-UdECM的matrisome比较
解析蜕膜化是否赋予ECM独特的促再生分子特征。
对CEndo-UdECM和DEndo-UdECM进行蛋白组学分析，比较Matrisome蛋白组成、差异丰度及GO富集。
Tβ4@PLGA微球与复合水凝胶制备及表征
构建可注射、温敏成胶并持续释放Tβ4的复合水凝胶。
采用W/O/W双乳液溶剂挥发法制备Tβ4@PLGA微球，将其混入DEndo-UdECM预凝胶；检测流变、SEM、粒径、包封率、载药量、体外降解、溶胀和Tβ4释放。
体外促再生与抗纤维化功能验证
验证DEndo-UdECM的促增殖、迁移、成管作用及Tβ4的抗纤维化作用。
以明胶为对照，通过Transwell共培养、EdU、Ki67、划痕和HUVEC成管实验评估DEndo-UdECM；在TGF-β1诱导的hESC纤维化模型中检测Tβ4对纤维化标志物的影响。
小鼠IUA模型体内治疗与组织学评估
评估复合水凝胶对子宫内膜结构再生和纤维化的体内疗效。
95%乙醇损伤左侧子宫角后即刻宫腔注射各处理，14天后取子宫进行H&E、Masson、FOXA2、α-SMA/COL1免疫荧光及形态计量。
生育力恢复评估
验证子宫内膜功能是否恢复至支持胚胎着床和活产。
术后两周与生育雄鼠交配，检查阴栓，GD8统计植入点，GD19统计活产仔数并观察子代发育。
免疫微环境、再生标志物及机制通路检测
阐明水凝胶促再生和抗纤维化的免疫与分子机制。
通过CD86/iNOS/Arg-1/CD206免疫荧光和流式检测巨噬细胞极化；检测Pan-CK/ALDH1A1、CD34、Ki67；Western blot检测焦亡和TGF-β/Smad3通路蛋白；检测容受性标志物。
体内生物相容性与安全性评估
评估水凝胶的全身毒性和局部组织反应。
IUA模型动物14天后取心、肝、脾、肺、肾进行H&E；健康小鼠背部皮下注射水凝胶，7、14、21天取皮肤组织学及IL-6、IL-1β免疫组化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Tβ4@PLGA微球制备 | 聚乳酸-羟基乙酸共聚物 | Jinan Daigang Biomaterial | P1066 |
| 微球制备 | 聚乙烯醇 | Sigma-Aldrich | 363138 |
| 蜕膜化模型 | 芝麻油 | Sigma-Aldrich | S3507 |
| 脱细胞处理 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| ECM消化 | 胃蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P7000 |
| 细胞培养对照 | 明胶 | Sigma-Aldrich | G9391 |
| 脱细胞处理 | 脱氧核糖核酸酶I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 |
| ECM溶解 | 盐酸 | Sangon Biotech | A100927 |
| Tβ4封装 | 重组人胸腺素β4 | ABclonal | RP10658 |
| 体外纤维化模型 | 重组人TGF-β1 | PeproTech | 100-21 |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | C11330500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141 | |
| 活性炭处理胎牛血清 | Gibco | 12676029 | |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 组织消化 | Hank平衡盐溶液 | Merck | H8264 |
| 细胞培养 | 青霉素-链霉素溶液 | HyClone | SV30010 |
| 成管实验 | Matrigel基底膜基质 | Corning | 356255 |
| 组织学染色 | H&E染色试剂盒 | Solarbio | G1120 |
| Masson三色染色试剂盒 | Solarbio | G1340 | |
| 细胞活性检测 | Calcein-AM/PI活/死细胞染色试剂盒 | Beyotime | C2015S |
| 细胞增殖检测 | BeyoClick™ EdU细胞增殖试剂盒 | Beyotime | C0071S |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | Beyotime | C1005 |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Beyotime | P0126 | |
| Tβ4定量 | Tβ4 ELISA试剂盒 | JONLNBIO | JL19928 |
| DNA定量 | DNeasy血液与组织试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| 流式细胞术 | Zombie Aqua™可固定活性染料试剂盒 | BioLegend | 423101 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠蜕膜化模型与DEndo-UdECM制备 | 假孕诱导方式、D4每侧子宫角10 μL芝麻油注射、D8取材、脱细胞试剂浓度与时间 阅读提示：Methods“Preparation and characterization of decidualized uterine extracellular matrix (DEndo-UdECM)”及Supplementary Fig. 1 |
| Tβ4@PLGA微球制备 | PLGA LA:GA=50:50、Mw 15 kDa、内水相5% w/v Tβ4、油相5% w/v PLGA、PVA 2% w/v、搅拌速度与时间 阅读提示：Methods“Fabrication of Tβ4@PLGA microspheres” |
| 小鼠IUA模型与体内给药 | 50 μL 95%乙醇损伤1 min、损伤后即刻30 μL宫腔注射、七组分组及每组n=24、14天取材 阅读提示：Methods“Animal models and study design”及Fig. 6a |
| 体外抗纤维化与细胞功能实验 | TGF-β1 10 ng/mL、Tβ4 100 nM处理48 h、hESC 5×10⁴ cells/well、Ishikawa 2×10⁴ cells/well、HUVEC 1×10⁴ cells/well 阅读提示：Methods“In vitro anti-fibrotic and cell migration assays”“Cell proliferation and cytotoxicity analyses”“In vitro angiogenesis assays” |
| 生育力评估 | 术后两周交配、每组n=6、阴栓日GD1、GD8统计植入点、GD19统计活产仔数 阅读提示：Methods“Reproductive performance and endometrial receptivity”及Fig. 7a |
| 巨噬细胞极化流式分析 | 每组n=3、组织消化酶组合与时间、F4/80+门内CD86+与CD206+分析、荧光扣除对照 阅读提示：Methods“Flow cytometry analysis of macrophage polarization”及Supplementary Fig. 8 |