临床队列筛选NACT应答相关分子
识别与NACT应答不良相关的差异表达基因和m6A调控因子。
对Cohort 1食管鳞癌组织进行转录组测序、GO和KEGG富集分析，分析20个m6A调控因子表达，并用IHC检测INCENP、CDCA8、YTHDF3蛋白。
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INCENP和CDCA8预测食管鳞状细胞癌新辅助化疗反应及结局
INCENP and CDCA8 predict neoadjuvant chemotherapy response and outcomes in esophageal squamous cell carcinoma.
实验完整度
高含临床队列转录组与IHC、细胞系敲低/过表达、PDXO类器官、裸鼠移植瘤体内验证及m6A/翻译机制验证
主要模型
食管鳞状细胞癌临床组织样本队列（Cohort 1-3） ESCC细胞系KYSE30、KYSE150、KYSE450等 PDX来源类器官（PDXO） 雌性NU/NU裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
NACT应答分组：应答者TRG0-1与非应答者TRG2-3，基于NCCN TRG标准 细胞系基础INCENP/CDCA8表达与紫杉醇、顺铂IC50的相关性 shINCENP/shCDCA8或过表达后紫杉醇、顺铂IC50及平板克隆形成变化 m6A位点：INCENP 5′UTR第113位GGACT、CDCA8 3′UTR第1041位GGACT的meRIP-qPCR及双荧光素酶验证 体内给药：紫杉醇10 mg/kg每周腹腔注射、顺铂10 mg/kg每周腹腔注射、Ebselen 20 mg/kg每周五次腹腔注射
摘要
新辅助化疗（NACT）是多种癌症的关键策略，可显著改善患者预后和5年生存率。然而，许多患者对NACT产生耐药，因而无法从中获益。因此，识别可靠的生物标志物以预测患者对NACT的应答仍是一项关键挑战。在此，我们证明INCENP和CDCA8表达升高导致多种癌症对NACT应答不良。机制上，INCENP的5′UTR（第113位GGACT）和CDCA8的3′UTR（第1041位GGACT）发生m⁶A甲基化并被YTHDF3识别，YTHDF3通过与eIF3A相互作用促进其翻译，最终驱动对NACT的不良应答。此外，抑制INCENP和CDCA8通过促进多极纺锤体形成增强NACT敏感性。总之，我们的发现确立INCENP和CDCA8可作为预测NACT应答的关键生物标志物，并作为与NACT联合治疗以提高患者生存的潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- INCENP和CDCA8是否可作为预测新辅助化疗应答的生物标志物，以及其调控NACT应答的分子机制是什么。
- 核心机制
- METTL3催化INCENP 5′UTR和CDCA8 3′UTR的m6A甲基化，YTHDF3识别m6A后与eIF3A相互作用促进二者翻译，导致多极纺锤体调控异常和NACT耐药。
- 主要证据
- 多个ESCC临床队列IHC显示非应答者INCENP、CDCA8、YTHDF3升高；细胞系敲低/过表达改变紫杉醇和顺铂IC50；PDXO和裸鼠移植瘤验证；meRIP-qPCR、RIP-qPCR、双荧光素酶、co-IP和PLA验证m6A-YTHDF3-eIF3A翻译调控链路。
- 研究意义
- INCENP和CDCA8可作为预测NACT应答的生物标志物，并作为与NACT联合治疗的潜在治疗靶点以改善患者生存。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
YTHDF3调控的蛋白质组与细胞周期表型验证
确定YTHDF3下游与有丝分裂相关的候选靶基因。
对shYTHDF3 ESCC细胞进行非标记蛋白质组学、GO/GSEA分析，检测CPC组分表达，并用流式细胞术和免疫荧光检测细胞周期与多极纺锤体。
INCENP和CDCA8对化疗敏感性的功能验证
验证INCENP和CDCA8表达是否影响ESCC细胞对紫杉醇和顺铂的敏感性。
在多种ESCC细胞系中检测基础表达与IC50相关性，进行敲低或过表达后MTT法IC50测定和平板克隆形成实验，并行裸鼠皮下移植瘤体内验证。
m6A修饰及YTHDF3识别的机制验证
验证INCENP和CDCA8 mRNA的m6A甲基化及YTHDF3的m6A依赖识别。
构建YTHDF3 m6A结合突变体（W438/W492）、METTL3敲低细胞和PDXO，检测INCENP/CDCA8蛋白、细胞周期和多极纺锤体；用meRIP-qPCR定位m6A位点。
YTHDF3-eIF3A翻译调控验证
阐明YTHDF3促进INCENP和CDCA8翻译的分子途径。
RIP-seq和RIP-qPCR检测YTHDF3结合，蛋白合成 assay、SUnSET和双荧光素酶检测翻译效率，co-IP、免疫荧光和PLA检测YTHDF3与eIF3A相互作用，eIF3A RIP-qPCR检测结合。
m6A位点功能依赖性验证
验证INCENP和CDCA8的m6A位点对其调控NACT应答的必要性。
在YTHDF3敲低ESCC细胞中转染WT或m6A位点突变INCENP/CDCA8，检测多极纺锤体及紫杉醇/顺铂敏感性。
多癌种预测价值与预后分析
评估INCENP、CDCA8、YTHDF3在多种癌症中对NACT应答的预测价值及与生存的关系。
在Cohort 3的ESCC、肺癌和乳腺癌治疗前活检样本中进行IHC，结合Kaplan-Meier生存分析和ROC曲线分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | VivaCell | C3010-0500 |
| DMEM高糖培养基 | VivaCell | C3110-0500 | |
| 胎牛血清 | VivaCell | 2302008 | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | PC0020 |
| RNA提取与RT-qPCR | 逆转录试剂盒 | Vazyme | R323 |
| SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711 | |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| 免疫组织化学 | 兔/鼠SP检测试剂盒 | ZSGB-BIO | SP9001 |
| m6A RNA甲基化定量 | EpiQuik m6A RNA甲基化定量试剂盒（比色法） | -- | -- |
| meRIP | EpiQuik CUT&RUN m6A RNA富集试剂盒 | -- | -- |
| RIP-seq | 抗YTHDF3抗体 | Abcam | ab220161 |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 | |
| KC-DigitalTM链特异性mRNA文库构建试剂盒 | Wuhan Seqhealth Co., Ltd | DR08502 | |
| 蛋白质合成实验 | Click-iT OPP | -- | -- |
| PLA | Duolink原位红色起始试剂盒（鼠/兔） | -- | -- |
| 动物实验 | 啮齿动物饲料 | Beijing keao xieli feed co., LTD | 1016706476803973120 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床队列NACT应答分组 | TRG评分标准（NCCN TRG）及应答者TRG0-1与非应答者TRG2-3的界定；各队列样本量 阅读提示：Results第一段及Fig. 1a、Fig. 1 legend |
| 细胞系药物敏感性检测 | 紫杉醇和顺铂处理浓度范围、处理时间72 h、MTT法每孔1500细胞、独立实验重复数n=4 阅读提示：Methods细胞增殖与克隆形成实验部分及Fig. 2 legend |
| m6A位点meRIP-qPCR | INCENP 5′UTR第113位GGACT、CDCA8 CDS第909位TGACT和3′UTR第1041位GGACT；METTL3敲低细胞系及n=3生物学重复 阅读提示：Results m6A位点部分、Fig. 6a-d legend及Methods meRIP assay |
| 裸鼠移植瘤体内给药 | KYSE150细胞5×10^6皮下接种；紫杉醇10 mg/kg每周腹腔注射、顺铂10 mg/kg每周腹腔注射、Ebselen 20 mg/kg每周五次腹腔注射；Mock/shINCENP/shCDCA8每组n=5，Ebselen组每组n=6 阅读提示：Methods In vivo study部分及Fig. 2i、Fig. 3i、l legend |
| YTHDF3与eIF3A相互作用检测 | co-IP抗体种属与用量、PLA探针（抗兔PLUS/抗鼠MINUS）、PLA n=5生物学重复 阅读提示：Methods Co-immunoprecipitation、Proximity ligation assay部分及Fig. 5j-m legend |