EPMolGen模型构建与干实验评估
验证模型生成分子的能力及静电特征对性能的贡献。
构建基于自回归流的分子生成模型，在ZINC和CrossDocked2020数据集上训练，并与LiGAN、Pocket2Mol、GraphBP、TargetDiff和PocketFlow等模型比较生成分子的有效性、QED、logP、SA、LE和ChemScore；进行消融分析。
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深度学习辅助发现一种强效且具有细胞活性的RNA N6-甲基腺苷识别蛋白YTHDC2抑制剂
Deep learning-assisted discovery of a potent and cell-active inhibitor of RNA N6-methyladenosine recognition protein YTHDC2.
实验完整度
高包含深度学习模型构建与干实验验证、体外生化结合实验、细胞水平功能与机制验证，多层级证据相互独立。
主要模型
MH7A细胞（人RA-FLS细胞系） PANC-1和MiaPACA-2细胞（PDAC细胞系） HepG2细胞（肝细胞癌细胞系） YTHDC2 YTH结构域重组蛋白及突变体
重点核对
FP实验：GST-YTHDC2蛋白650 nM与FAM-m6A-mRNA探针7 nM孵育，化合物与蛋白预孵30 min后加探针再孵2 h ITC实验：YTHDC2蛋白580 μM滴定至DC2-C1（5-20 μM），测定KD DSF实验：2 μM YTHDC2蛋白与5× SYPRO orange及DC2-C1（6.25、3.13、1.56、0.78、0 μM）加热，测定Tm CETSA/DARTS：HEK293T细胞转染YTHDC2 YTH结构域，DC2-C1或16o 30 μM处理24 h RIP-qPCR：MH7A和PANC-1细胞（1×10^7/样本）用DC2-C1或16o 30 μM处理12 h
摘要
YTHDC2是一种独特的含YTH结构域的蛋白，可识别RNA上的N6-甲基腺苷（m6A），在多种病理过程中发挥关键作用，是一个有前景的治疗靶点。尽管具有潜力，迄今尚未报道强效的小分子抑制剂。为填补这一空白，我们开发了EPMolGen，一种显式纳入受体蛋白静电特征的深度学习分子生成模型。该模型在干实验验证中达到最先进性能。利用EPMolGen，我们鉴定出H3，一种YTHDC2抑制剂，IC50为16.84 μM。随后对H3进行结构优化，得到DC2-C1，一种高效化合物，对YTHDC2的IC50为0.168 μM，并对其他YTH结构域蛋白具有选择性。在细胞实验中，DC2-C1有效靶向YTHDC2。值得注意的是，DC2-C1处理显著降低了YTHDC2多个靶mRNA的表达水平，导致相关细胞的表型抑制。总体而言，本研究凸显了深度学习在药物发现中的巨大潜力，并为靶向YTHDC2的药物开发提供了一种有前景的先导化合物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否发现靶向YTHDC2 YTH结构域的强效、选择性且具有细胞活性的小分子抑制剂？
- 核心机制
- DC2-C1结合YTHDC2的m6A识别口袋，阻断YTHDC2与靶mRNA（如AMIGO2）结合，降低靶mRNA稳定性及蛋白表达，从而抑制相关细胞表型。
- 主要证据
- FP实验显示DC2-C1对YTHDC2的IC50为0.168 μM；ITC测得KD为0.46 μM；DSF显示热稳定化；突变体DSF、NMR和UVPD-MS验证结合位点；RIP-qPCR、RNA稳定性、RT-qPCR和Western blot显示DC2-C1降低AMIGO2等靶mRNA及蛋白表达并抑制细胞增殖、迁移和侵袭。
- 研究意义
- 本研究凸显深度学习在药物发现中的潜力，并为靶向YTHDC2的药物开发提供有前景的先导化合物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生成靶向YTHDC2的候选分子并筛选命中化合物
获得靶向YTHDC2 YTH结构域的小分子并测试其抑制活性。
以YTHDC2 YTH结构域晶体结构（PDB ID: 6K6U）的m6A结合口袋为靶点，用EPMolGen生成5,000个分子，筛选QED>0.8且按LE排序的前15个分子中选取5个（H1-H5）合成，通过FP实验测定IC50。
H3的结构优化与构效关系分析
提高命中化合物H3对YTHDC2的抑制活性。
对H3的R1（苄基）和R2（4-氯苯酚）区域进行结构优化，合成系列化合物（14a-m和16a-n），通过FP实验测定IC50，确定最优取代基，获得DC2-C1。
DC2-C1的体外生物活性与结合模式验证
验证DC2-C1对YTHDC2的抑制活性、结合亲和力、选择性和结合位点。
通过FP实验测定DC2-C1对YTHDC2及其他YTH家族蛋白的IC50；ITC测定KD；DSF测定热稳定化；突变体DSF验证结合残基；NMR和UVPD-MS验证结合口袋。
DC2-C1在活细胞中的靶点结合验证
验证DC2-C1在活细胞中与YTHDC2 YTH结构域的直接结合。
在转染Flag-YTHDC2-(YTH domain)的HEK293T细胞中，用CETSA和DARTS实验检测DC2-C1或阴性对照16o对YTHDC2热稳定性和蛋白酶敏感性的影响。
DC2-C1在RA-FLS中的细胞功能与机制验证
验证DC2-C1通过抑制YTHDC2-m6A结合影响AMIGO2表达及RA-FLS表型。
在MH7A细胞中，通过RIP-qPCR检测YTHDC2与AMIGO2 mRNA结合；RNA稳定性实验检测AMIGO2 mRNA降解；RT-qPCR和Western blot检测AMIGO2表达； colony formation和Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭。
DC2-C1在PDAC细胞和肝细胞中的细胞活性及选择性验证
验证DC2-C1对YTHDC2在其他细胞背景下的功能影响及对其它YTH蛋白靶mRNA的选择性。
在PANC-1、MiaPACA-2、HepG2、HGC27细胞中，用Western blot检测H3K4me3、ID2、FZD7等，RT-qPCR检测ACC1、FASN、SREBP-1C、FZD7、ID2 mRNA， colony formation和Transwell检测细胞表型。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质表达与纯化 | pGEX-6P-1载体 | -- | -- |
| 大肠杆菌BL21 (DE3) | -- | -- | |
| 异丙基-1-硫代-D-半乳糖苷 | -- | -- | |
| PreScission蛋白酶 | -- | -- | |
| SuperdexTM 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | -- | |
| ÄKTA pure | Cytiva | -- | |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | -- | |
| 荧光偏振实验 | FAM-m6A-mRNA | -- | -- |
| CLARIOstar PLUS | -- | -- | |
| DSF实验 | SYPRO橙色染料 | Sigma | S5692 |
| ITC实验 | MicroCal PEAQ-ITC | -- | -- |
| 细胞培养 | 高糖DMEM | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| RPMI-1640 | Gibco | -- | |
| MEM | Gibco | -- | |
| 细胞活力实验 | MTT | Sigma | -- |
| 细胞迁移和侵袭实验 | 基质胶 | LABLEAD | MG2237 |
| Transwell小室（8-μm孔径） | LABSELECT | 14341 | |
| 结晶紫 | Beyotime | C0121 | |
| 倒置显微镜（Olympus IX73） | Evident | -- | |
| 病毒包装与感染 | lentiCRISPR v2-CMV-ZsGreen-Puro载体 | Tsingke Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| psPAX2 | -- | -- | |
| pMD2.G | -- | -- | |
| Hieff Trans®脂质体2000转染试剂 | YEASEN | 40802ES03 | |
| 聚brene | YEASEN | 40804ES76 | |
| 嘌呤霉素 | YEASEN | 60209ES10 | |
| 瞬时转染 | PCDH-GFP-Puro-3xFlag载体 | -- | -- |
| CETSA实验 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 |
| PMSF | TargetMol | T0789 | |
| DARTS实验 | NP-40裂解液 | Beyotime | P0013F |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 | |
| 链霉蛋白酶 | Roche | PRON-RO | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013C |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| SuperLumia ECL plus HRP底物试剂盒 | Abbkine | K22030 | |
| 化学发光检测仪（FUSION-FX6.EDGE V.070） | -- | -- | |
| YTHDC2抗体 | ZenBio | R27443 | |
| AMIGO2抗体 | ImmunoWay | YN2372 | |
| ID2抗体 | HUABIO | M1301-2 | |
| H3K4me3抗体 | Abcam | ab8580 | |
| FZD7抗体 | Proteintech | 16974-1-AP | |
| DYKDDDDK标签（Flag标签）抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| HRP偶联Affinipure山羊抗兔IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| HRP偶联Affinipure山羊抗鼠IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| RT-qPCR | 细胞总RNA分离试剂盒 | Foregene | RE-03113 |
| Hifair® III第一链cDNA合成预混液（含gDNA消化酶） | YEASEN | 11141ES60 | |
| Hieff® qPCR SYBR Green预混液（No Rox） | YEASEN | 11201ES08 | |
| RIP-qPCR | PureBinding® RNA免疫沉淀试剂盒 | GENESEED | P0102 |
| IgG抗体 | Beyotime | A7016 | |
| Native UVPD-MS | Thermo Fusion Lumos质谱仪 | Thermo | -- |
| NMR | Avance III Bruker波谱仪 | Bruker | -- |
| QCI-F冷冻探头 | Bruker | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| FP实验 | GST-YTHDC2浓度650 nM；FAM-m6A-mRNA探针浓度7 nM；化合物与蛋白预孵育30 min，加探针后孵育2 h；缓冲液20 mM HEPES pH 7.5，180 mM NaCl 阅读提示：Methods中Fluorescence polarization (FP) assay小节及Fig. 3图注 |
| ITC实验 | YTHDC2蛋白浓度580 μM；DC2-C1浓度5-20 μM；缓冲液20 mM Tris-HCl pH 7.5，150 mM NaCl 阅读提示：Methods中Isothermal titration calorimetry (ITC) assay小节及Fig. 5c图注 |
| DSF实验 | YTHDC2蛋白浓度2 μM；SYPRO orange 5×；DC2-C1浓度6.25、3.13、1.56、0.78、0 μM；加热范围25-95°C，升温速率1°C/15 s 阅读提示：Methods中Differential scanning fluorimetry (DSF) assay小节及Fig. 5d,e图注 |
| CETSA/DARTS实验 | HEK293T细胞转染YTHDC2 YTH结构域；DC2-C1或16o浓度30 μM，处理24 h；CETSA温度梯度未明确说明；DARTS pronase浓度0-10%（w/w） 阅读提示：Methods中Cellular thermal shift assay (CETSA)和Drug affinity responsive target stability (DARTS)小节及Fig. 6f,g图注 |
| RIP-qPCR实验 | MH7A和PANC-1细胞数量1×10^7/样本；DC2-C1或16o浓度30 μM，处理12 h；YTHDC2抗体或IgG抗体4°C孵育2 h 阅读提示：Methods中RNA immunoprecipitation (RIP-qPCR) assay小节及Fig. 7a图注 |
| RNA稳定性实验 | MH7A和HepG2细胞；DC2-C1或16o浓度30 μM预处理24 h；actinomycin D浓度5 μg/mL；收样时间0、2、4、6、8 h 阅读提示：Methods中RNA stability assay小节及Fig. 7b图注 |
| 细胞功能实验（集落形成、迁移、侵袭） | MH7A细胞接种密度1000 cells/well（12-well）；PANC-1和MiaPACA-2细胞400 cells/well；DC2-C1或16o浓度25 μM；处理时间10-14天（集落形成）或48 h（迁移侵袭） 阅读提示：Methods中Cell colony formation assay和Cell migration and invasion assays小节及Fig. 7f-i、Fig. 8c,d图注 |