自噬诱导与sEVs尺寸分布分析
探究自噬反应对sEVs分泌量和粒径分布的影响。
用血清饥饿、雷帕霉素或巴弗洛霉素A1处理细胞，收集上清，差速离心分离sEVs，NTA检测粒径分布和浓度；并在小鼠饥饿模型中检测血清sEVs。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
自噬性细胞外囊泡（AEVs）不同于外泌体并在病毒感染中发挥关键作用
Autophagic extracellular vesicles (AEVs) are distinct from exosomes and play crucial roles in viral infections.
实验完整度
高包含体外细胞系、基因敲除/敲低、蛋白质组学、小鼠模型及临床血清样本，并进行了功能与机制验证。
主要模型
HEK-293T细胞（野生型及基因敲除/敲低） 多种细胞系（Neuro-2a、THP-1、SH-SY5Y、ARPE-19、HeLa、NIH 3T3、L929） C57BL/6J小鼠（野生型及Rab27a-KO） 健康男性血清样本（年轻组与老年组）
重点核对
自噬诱导条件：血清饥饿24小时、雷帕霉素100 nM处理24小时、巴弗洛霉素A1 20 nM处理24小时 基因敲除/敲低验证：TSG101、ATG7、Rab11、CD63、Rab13、Rab27a敲除；CHMP4A/B、VPS4A/B等siRNA敲低 AEVs分离方法：0.22 μm和0.1 μm过滤后，40,000×g离心60分钟，再100,000×g超速离心90分钟 病毒感染的剂量与时间：CVB4 0.05 TCID50、EV71 0.03 TCID50感染24小时 动物实验：野生型及Rab27a-KO小鼠禁食48小时；每只小鼠腹腔注射5×10^7 CVB4感染细胞来源的AEVs，每组n=6
摘要
新兴证据表明自噬与小细胞外囊泡分泌之间存在重要联系。然而，我们对这些分泌囊泡的理解仍不完整。在此，我们鉴定了一种小细胞外囊泡亚型，称为自噬性细胞外囊泡（AEVs），其不同于外泌体。细胞外AEVs的特征是尺寸小于100 nm，当自噬反应被诱导时其分泌增加。双膜体（amphisomes），即杂交细胞器，对于这类囊泡的分泌至关重要。进一步探索揭示，自噬货物、某些ESCRT Ⅲ组分以及Rab13可作为区分AEVs与外泌体的独特标志物。此外，我们发现AEVs的生物发生功能上需要ESCRT Ⅲ复合物组分和GTP酶Rab27a。最后，我们证实肠道病毒颗粒或基因组可被包裹进AEVs，并随后以高效率感染受体阴性细胞。该模型代表了EV介导病毒传播的一种突出模式。
作者鉴定了一种小细胞外囊泡亚型，称为自噬性细胞外囊泡。这类囊泡表现出不同于外泌体的生物标志物，并在病毒感染中发挥关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 自噬反应如何影响小细胞外囊泡的分泌，是否存在不同于外泌体的自噬相关囊泡亚型，以及该亚型在病毒感染中的作用。
- 核心机制
- 自噬诱导后，自噬体与多囊体（MVBs）经Rab11融合形成双膜体；AEVs的生物发生需要ESCRT-III组分CHMP4A/CHMP4B和VPS4A/B介导的膜分裂，Rab13参与将自噬货物和ESCRT组分分选入AEVs，Rab27a则介导AEVs的胞外分泌。
- 主要证据
- 通过NTA和RPS检测发现自噬诱导增加<100 nm sEVs分泌；TSG101敲除不影响而ATG7或Rab11敲除抑制该分泌；蛋白质组学、免疫电镜、蛋白酶保护实验和密度梯度离心鉴定AEVs标志物； Rab27a敲除小鼠中AEVs分泌不增加；AEVs可包裹CVB4或EV71并感染非许可细胞。
- 研究意义
- AEVs代表一种不同于外泌体的小细胞外囊泡亚型，扩展了细胞外囊泡异质性的认识；AEVs介导的病毒传播拓宽了病毒嗜性，提示其在病毒感染传播中的潜在作用，并可能作为疾病诊断或治疗反应的指标。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
自噬相关囊泡与外泌体的区分
验证<100 nm sEVs的增加是否依赖于自噬体形成而非外泌体生物发生。
构建TSG101-KO、ATG7-KO、Rab11-KO、CD63-KO细胞，在饥饿条件下分离囊泡，Western blot检测自噬货物和外泌体标志物，NTA检测<100 nm囊泡比例。
AEVs的分离纯化与蛋白组成分析
建立AEVs纯化方法并鉴定其蛋白质组成特征。
比较两种差速离心联合过滤方法（Method A和Method B），用NTA评估纯度；对纯化的AEVs进行定量蛋白质组学、GO富集分析和Western blot验证。
AEVs标志物鉴定与验证
确定区分AEVs与外泌体的独特标志物。
通过蛋白质组学比较野生型、Rab11-KO、Rab13-KO细胞来源的AEVs，Western blot验证Rab13、ESCRT-III组分和自噬货物；免疫电镜定位LC3B、p62、Rab13；蛋白酶保护实验分析膜定位。
Rab13在AEVs货物分选中的功能
研究Rab13对AEVs形成和货物分选的影响。
构建Rab13-KO细胞，检测AEVs分泌量和货物蛋白；免疫荧光观察Rab13与LC3B、p62、CD63共定位；流式分选双膜体；超分辨显微镜观察AEVs亚型。
ESCRT-III和Rab27a在AEVs生物发生中的作用
验证ESCRT-III组分和Rab27a对AEVs生成和分泌的功能必要性。
siRNA敲低CHMP4A/B、VPS4A/B等，检测AEVs分泌；TEM观察双膜体形态；构建Rab27a-KO细胞和小鼠，检测AEVs分泌。
AEVs包裹肠道病毒并感染非许可细胞
验证AEVs能否携带肠道病毒颗粒或基因组并扩大病毒嗜性。
CVB4或EV71感染细胞，分离AEVs，TEM观察病毒颗粒，Western blot检测VP1，RT-qPCR检测病毒RNA；用AEVs处理HeLa、NIH 3T3、L929细胞，检测感染和病毒复制；小鼠腹腔注射AEVs，检测组织病毒RNA和生存率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | -- |
| RPMI 1640培养基 | HyClone | -- | |
| DMEM/F12培养基 | HyClone | -- | |
| 胎牛血清 | ExCell Bio | -- | |
| 支原体检测 | PlasmoTest支原体检测试剂 | InvivoGen | -- |
| 自噬诱导 | 巴弗洛霉素A1 | TargetMol | -- |
| 雷帕霉素 | TargetMol | -- | |
| 细胞死亡检测 | LDH检测试剂盒 | DOJINDO | CK12 |
| 质粒 | pCMV-GFP-LC3B质粒 | Beyotime Biotechnology | D2815 |
| pCMV-CD63-mCherry质粒 | Beyotime Biotechnology | D2841 | |
| CRISPR-Cas9基因敲除 | pSpCas9(BB)-2A-Puro质粒 | Addgene | 48139 |
| BbsI酶 | New England Biolabs | R3539 | |
| T4连接酶 | Takara | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| sEVs分离 | 0.22微米孔径滤膜 | Millipore | -- |
| Optima L-100 XP超速离心机 | Beckman Coulter | -- | |
| NTA检测 | Nano NS300仪器 | Malvern Instruments | -- |
| SQSTM1/p62抗体偶联Alexa Fluor 488 | Abcam | ab185015 | |
| RPS检测 | Nanocoulter计数器 | Resen Technology | -- |
| 密度梯度离心 | 碘克沙醇 | Sigma‑Aldrich | -- |
| SW40 Ti转子 | Beckman Coulter | -- | |
| 蛋白酶保护实验 | 胰蛋白酶 | Gibco | -- |
| Triton X-100 | Sigma‑Aldrich | -- | |
| PBA分析 | 生物素化霍乱毒素B亚基 | -- | -- |
| 质谱分析 | Orbitrap Astral质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| Vanquish Neo系统液相色谱 | Thermo Scientific | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Santa Cruz | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| SQSTM1/p62抗体 | Abcam | ab109012 | |
| CD9抗体 | Abcam | ab236630 | |
| CD63抗体 | Abcam | ab193349 | |
| CHMP2A抗体 | Proteintech | 10477-1-AP | |
| VPS4A/B抗体 | Proteintech | 17673-1-AP | |
| LC3B抗体 | Abclonal | A19665 | |
| NBR1抗体 | Proteintech | 16004-1-AP | |
| TSG101抗体 | Proteintech | 14497-1-AP | |
| SDCBP/Syntenin-1抗体 | Proteintech | 2239-1-AP | |
| CD81抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | |
| Rab13抗体 | Abclonal | A10571 | |
| GAPDH抗体 | Abclonal | AC033 | |
| CD81抗体 | R&D | MAB4615 | |
| Calreticulin抗体 | Cell Signaling technology | 12238 | |
| Rab7抗体 | Cell Signaling technology | 9367 | |
| α-tubulin抗体 | Cell Signaling technology | 5335 | |
| Rab11抗体 | Cell Signaling technology | 5589 | |
| Rab5抗体 | Cell Signaling technology | 3547 | |
| EEA1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-137130 | |
| 肠道病毒71型VP1抗体 | GeneTex | GTX132339 | |
| 免疫荧光 | 鼠抗CD63抗体 | Abcam | ab193349 |
| 兔抗Rab13抗体 | Abclonal | A10572 | |
| 鼠抗LC3B抗体 | Abclonal | A17424 | |
| 鼠抗p62抗体 | Abcam | 56416 | |
| 兔抗CD63抗体 | Abcam | ab252919 | |
| DAPI染料 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 透射电镜 | 环氧树脂 | Sigma-Aldrich | 45345 |
| 免疫电镜 | LC3B抗体 | MBL | M152-3 |
| p62抗体 | MBL | PM045 | |
| Rab13抗体 | Abclonal | A10571 | |
| 抗鼠IgG金标抗体 | Sigma‑Aldrich | G7777 | |
| 抗兔IgG金标抗体 | Sigma‑Aldrich | 7402 | |
| 流式分选 | FACSAria Ⅲ细胞分选仪 | BD | -- |
| 病毒RNA提取 | TRIzol试剂 | TaKaRa | -- |
| 逆转录 | 逆转录试剂盒 | TaKaRa | -- |
| 实时定量PCR | SYBR-Green预混液 | Life Technologies | -- |
| ABI QuantStudio 6 Flex实时PCR仪 | Life Technologies | -- | |
| 病毒纯化 | Protein A/G磁珠 | Millipore | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与自噬诱导 | 血清饥饿时间24小时；雷帕霉素浓度100 nM；巴弗洛霉素A1浓度20 nM；处理时间24小时；FBS需超速离心去除EVs（120,000×g，3小时） 阅读提示：Methods: Cell culture, virus strains and plasmids |
| AEVs分离 | 过滤孔径0.22 μm和0.1 μm；40,000×g离心60分钟；100,000×g离心90分钟；所有离心温度4°C 阅读提示：Methods: Preparation of small extracellular vesicles (sEVs) and autophagic extracellular vesicles (AEVs) |
| 基因敲除细胞系构建 | sgRNA序列；puromycin浓度2 μg/mL筛选3天；单克隆筛选3周；敲除验证方法Western blot 阅读提示：Methods: Generation of CRISPR-Cas9 KO cell lines |
| 病毒感染的AEVs实验 | CVB4感染剂量0.05 TCID50；EV71感染剂量0.03 TCID50；感染时间24小时；使用10% EV去除FBS培养基 阅读提示：Methods: Preparation of small extracellular vesicles (sEVs) and autophagic extracellular vesicles (AEVs); Analysis of vesicles-enclosed enterovirus infection |
| 动物实验 | 小鼠品系C57BL/6J；禁食时间48小时；CVB4-AEVs注射量来自5×10^7感染细胞；每组n=6；观察10天 阅读提示：Methods: Animal experiment |
| NTA检测 | 样品浓度1×10^7/ml至1×10^9/ml；温度25~26°C；注射泵速度40 μl/s；每次60秒视频，三次记录 阅读提示：Methods: Nanoparticle tracking analysis (NTA) for particle size and concentration of EVs |