鉴定SPL/NZZ互作蛋白
寻找在胚珠早期发育中与SPL/NZZ相互作用的蛋白。
利用pSPL/NZZ::SPL/NZZ:GFP AP1:GR ap1cal诱导体系，在9 DAI收集花序，进行Co-IP/MS，以anti-GFP抗体富集，鉴定SPL/NZZ互作蛋白。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
SPOROCYTELESS/NOZZLE与MADS域转录因子协同调控依赖生长素的网络控制大孢子母细胞分化
SPOROCYTELESS/NOZZLE cooperates with MADS-domain transcription factors to regulate an auxin-dependent network controlling Megaspore-Mother-Cell differentiation.
实验完整度
高多组学（Co-IP/MS、ChIP-seq、RNA-seq）结合遗传互作、FRET-FLIM、酵母双/三杂交及体内功能验证。
主要模型
拟南芥Col-0野生型与spl-1突变体胚珠 pSPL/NZZ::SPL/NZZ:GFP AP1:GR ap1cal诱导体系 本氏烟草叶片瞬时表达
重点核对
Co-IP/MS使用3个生物学重复的SPL/NZZ:GFP AP1:GR ap1cal花序（9 DAI），anti-GFP抗体富集，FDR≤0.05。 ChIP-seq使用3个生物学重复，anti-GFP抗体（Abcam ab290），峰需在至少2/3重复中出现，FDR≤0.05。 RNA-seq比较野生型与spl-1雌蕊（阶段9），3个生物学重复，DESeq2分析，FDR≤0.05。 FRET-FLIM在烟草叶片中瞬时表达SEP3Δ-GFP或STK-GFP与SPL/NZZΔ-mCHERRY，测量GFP寿命。 遗传互补实验使用pSPL/NZZ::PIN1、pSPL/NZZ::shy2.6、pSPL/NZZ::MP、pSPL/NZZ::ARF9等构建体转化相应基因型。
摘要
雌配子的形成是一个复杂的发育过程，始于胚珠内大孢子母细胞（MMC）的分化。SPOROCYTELESS/NOZZLE（SPL/NZZ）是MMC形成的主要调控因子，因为SPL/NZZ基因突变导致MMC分化失败。然而，调控MMC发育的SPL/NZZ依赖的调控通路仍 largely 未知。利用多组学方法，我们鉴定了SPL/NZZ的直接靶标及其下游网络。我们发现SPL/NZZ与胚珠身份MADS域转录因子复合体互作以调控共同靶基因的表达。通过整合组学数据与互补或突变体品系分析，我们描述了一个全面的调控机制，其中SPL/NZZ通过作用于依赖生长素的下游网络来控制MMC的分化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SPL/NZZ依赖的调控通路如何控制大孢子母细胞（MMC）的分化？
- 核心机制
- SPL/NZZ与胚珠身份MADS域转录因子（如SEP3、STK）形成复合体，抑制珠心区查拉扎身份基因（如ANT）的表达，间接促进PIN1表达和生长素积累，进而通过Aux/IAA降解激活ARF（如ARF9）介导的生长素响应，驱动MMC分化。
- 主要证据
- Co-IP/MS鉴定SPL/NZZ与MADS域转录因子互作；ChIP-seq显示SPL/NZZ与SEP3共享超过90%的结合峰；RNA-seq揭示spl-1中生长素通路基因失调；遗传实验表明pSPL/NZZ::PIN1或pSPL/NZZ::ARF9可恢复spl-1的MMC分化，而pSPL/NZZ::shy2.6模拟spl-1表型。
- 研究意义
- 提供了SPL/NZZ通过生长素依赖网络调控MMC分化的分子机制，增进了对植物雌性生殖细胞发育的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证SPL/NZZ与MADS域转录因子的直接互作
验证SPL/NZZ是否与MADS域转录因子（AG、STK、SEP3）直接互作并形成复合体。
使用酵母双杂交和酵母三杂交实验，以及FRET-FLIM在烟草叶片中瞬时表达融合蛋白进行验证。
鉴定SPL/NZZ直接靶基因
鉴定SPL/NZZ在全基因组范围内的直接结合靶标。
利用pSPL/NZZ::SPL/NZZ:GFP AP1:GR ap1cal体系进行ChIP-seq，使用anti-GFP抗体，鉴定SPL/NZZ结合峰。
比较SPL/NZZ与SEP3靶基因重叠
验证SPL/NZZ与SEP3是否结合相同的基因组区域。
将SPL/NZZ ChIP-seq峰与已发表的SEP3 ChIP-seq数据集（8 DAI，相同诱导系统）进行比较。
分析spl-1突变体的转录组变化
鉴定SPL/NZZ缺失导致的差异表达基因及通路。
对野生型（Col-0）和spl-1突变体雌蕊（阶段9）进行RNA-seq，分析差异表达基因和GO富集。
验证MADS域转录因子在MMC分化中的功能
探究MADS域转录因子（SEP、STK、SHP）在MMC分化中的作用。
构建pSPL/NZZ::MADSas以在珠心中转录后沉默SEP基因，并导入shp1 shp2 stk/STK背景，观察MMC分化缺陷。
分析生长素运输和信号在spl-1中的变化
评估spl-1突变对生长素运输和响应的影响。
使用pPIN1::PIN1:GFP、DR5v2和R2D2报告系统，在野生型和spl-1胚珠中比较信号强度。
验证PIN1在spl-1中的恢复作用
测试在spl-1珠心中表达PIN1是否足以恢复MMC分化。
构建pSPL/NZZ::PIN1并转化spl-1突变体，观察MMC分化和胚珠发育。
验证ARF活性抑制是否模拟spl-1表型
测试在野生型珠心中表达抗生长素降解的shy2.6是否导致MMC分化缺陷。
构建pSPL/NZZ::shy2.6并转化野生型，观察MMC分化。
验证ARF9和MP在spl-1中的恢复作用
测试增加ARF9或MP水平是否能够恢复spl-1的MMC分化。
构建pSPL/NZZ::ARF9和pSPL/NZZ::MP并转化spl-1，观察MMC分化和减数分裂。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
鉴定DNA结合靶标
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Co-IP/MS | μMACS GFP分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-091-288 |
| 胰蛋白酶/Lys-C混合液，质谱级 | Promega | V5071 | |
| EASY-nLC 1200液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ChIP-seq | GFP抗体 | Abcam | ab290 |
| 蛋白A磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88845 | |
| DNA纯化浓缩试剂盒 | Zymo Research | D4004 | |
| ThruPLEX DNA测序文库构建试剂盒 | Takara Bio | R400674 | |
| SMARTer DNA独特双索引试剂盒 | Takara Bio | R400697 | |
| SPRIselect磁珠 | Beckman Coulter | B23317 | |
| RNA-seq | RNA保护试剂 | Macherey-Nagel | 740750.500 |
| RNA提取试剂盒 | Macherey-Nagel | -- | |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒 | Macherey-Nagel | 740984.50 |
| iScript逆转录预混液 | Bio-Rad | 1708840 | |
| iTaq通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 1725120 | |
| 原位杂交 | BCIP/NBT显色底物 | Promega | S3771 |
| 克隆 | Q5高保真DNA聚合酶 | NEB | -- |
| pDONR221质粒 | Invitrogen | 11789020 | |
| LR II Plus克隆试剂 | Invitrogen | 12538120 | |
| 共聚焦显微镜 | Renaissance2200荧光染料 | Renaissance Chemicals | SR2200 |
| Nikon AX共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Co-IP/MS | 3个生物学重复；9 DAI花序；anti-GFP抗体；FDR≤0.05；log2 intensity difference >0 阅读提示：Methods 'Co-IP/MS material generation and data analysis'及Figure 1A图注 |
| ChIP-seq | 3个生物学重复；9 DAI花序；anti-GFP抗体（Abcam ab290）；峰在至少2/3重复中出现；FE>0，FDR≤0.05 阅读提示：Methods 'ChIP-seq material generation and data analysis'及Figure 2A图注 |
| RNA-seq | 3个生物学重复；阶段9雌蕊；DESeq2分析；FDR≤0.05；测序深度30M reads，paired-end 阅读提示：Methods 'RNA-seq material generation and data analysis' |
| FRET-FLIM | 烟草叶片瞬时表达；SEP3Δ-GFP或STK-GFP单独或与SPL/NZZΔ-mCHERRY共表达；测量5-11个细胞核；GFP寿命约2.3/2.7 ns 阅读提示：Methods 'FRET-FLIM'及Figure 1I图注 |
| 遗传互补（pSPL/NZZ::PIN1） | 4个独立spl-1 pSPL/NZZ::PIN1株系；阶段2-II/2-III胚珠；观察MMC分化百分比 阅读提示：Results 'Restoring the auxin transport...'及Figure 4P图注 |
| pSPL/NZZ::shy2.6 | 3个独立pSPL/NZZ::shy2.6株系；阶段2-II/2-III胚珠；观察MMC分化百分比 阅读提示：Results 'The inhibition of ARFs activity...'及Figure 5M图注 |
| pSPL/NZZ::ARF9和pSPL/NZZ::MP | 3个独立spl-1 pSPL/NZZ::ARF9株系；2个独立spl-1 pSPL/NZZ::MP株系；阶段2-II/2-III胚珠；观察MMC分化及减数分裂 阅读提示：Results 'ARFs activity is required...'及Figure 6I-J图注 |