snRNA-seq鉴定gp120Tg小鼠脊髓星形胶质细胞亚群
鉴定HIV-1 gp120诱导的特定星形胶质细胞亚群及其转录组特征。
对4–5月龄WT和gp120Tg小鼠腰段脊髓进行单核RNA测序，使用10X Genomics平台，Seurat分析，鉴定星形胶质细胞亚群并进行差异基因和通路分析。
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在小鼠模型中鉴定HIV相关疼痛发病机制中的反应性星形胶质细胞亚群
Identification of a reactive astrocyte subpopulation during HIV-associated pain pathogenesis in mouse models.
实验完整度
高包含snRNA-seq、免疫荧光、Western blot、行为学及基因敲除小鼠验证，涵盖体外与体内多层级证据及功能验证。
主要模型
HIV-1 gp120转基因小鼠（Gfap-gp120Tg） Gal3全身敲除及星形胶质细胞特异性杂合敲除gp120Tg小鼠 HIV患者脊髓尸检样本
重点核对
gp120Tg小鼠年龄4–5个月，行为学测试使用混合雌雄，snRNA-seq等使用雄性 snRNA-seq每组3只小鼠腰段脊髓混合，10X Genomics Chromium v3化学，测序深度约15,000 reads/核 Gal3全身敲除（Gal3−/−）及星形胶质细胞特异性杂合敲除（Gfap-Cre×Lgals3-Flox）的基因型鉴定 机械性异常性疼痛von Frey测试采用Dixon up-and-down法，双盲设计 Western blot检测IL-1β、caspase-1、Wnt5a、Iba1等，上样量30 μg/孔
摘要
疼痛是HIV感染者的常见并发症，但其潜在致病机制仍知之甚少。在出现病理性疼痛的HIV患者脊髓背角中，反应性星形胶质细胞被选择性激活，提示其可能在疼痛发病机制中发挥作用。然而，这些反应性星形胶质细胞的具体致病亚型尚未被定义。在此，我们利用单核RNA测序在HIV-1 gp120转基因小鼠的腰段脊髓中鉴定出一个独特的疼痛相关反应性星形胶质细胞亚群。该星形胶质细胞亚群显示出与吞噬作用和炎症相关的转录组特征，其形成依赖于半乳糖凝集素-3。Lgals3（半乳糖凝集素-3）的全身性和星形胶质细胞特异性杂合敲除均显著减轻gp120转基因小鼠的机械性异常性疼痛。这些发现揭示了一个反应性星形胶质细胞亚群在重塑HIV相关疼痛背后的脊髓疼痛环路中发挥作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HIV相关疼痛中，反应性星形胶质细胞是否存在特定的致病亚群，以及该亚群如何参与疼痛发病机制。
- 核心机制
- gp120诱导脊髓中央管区Gal3+室管膜细胞向星形胶质细胞谱系分化并迁移形成HIPAs，HIPAs通过吞噬神经元和促进神经炎症参与疼痛环路重塑；Gal3缺失阻断HIPAs形成并减轻疼痛。
- 主要证据
- snRNA-seq鉴定gp120Tg小鼠脊髓中特异性cluster 7（HIPAs），表达炎症和吞噬基因；免疫荧光和Imaris三维重建显示HIPAs吞噬神经元成分；Gal3敲除消除HIPAs并减轻机械性异常性疼痛和热痛敏，减少神经元变性和神经炎症标志物。
- 研究意义
- 揭示了一个反应性星形胶质细胞亚群在HIV相关疼痛发病中的作用，为理解HIV疼痛的细胞机制提供了新视角，并提示Gal3+星形胶质细胞可能作为潜在的干预靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证Gal3作为HIPAs标志物
验证Gal3在gp120Tg小鼠脊髓星形胶质细胞中的特异性表达。
免疫荧光双染GFAP/Gal3和Iba1/Gal3，共聚焦成像和光学切片分析，Western blot检测Gal3蛋白水平。
评估HIPAs的吞噬能力
确定HIPAs是否具有吞噬神经元的能力。
免疫荧光标记NeuN和Gal3，ZEISS Airyscan超分辨共聚焦显微镜获取3D Z-stack图像，Imaris软件三维重建分析神经元成分被HIPAs吞噬；Fluoro-Jade C染色结合Gal3免疫荧光检测退化神经元与HIPAs的共定位。
Gal3敲除对HIPAs形成的影响
验证Gal3在HIPAs形成中的作用。
构建gp120Tg/Gal3−/−小鼠，进行snRNA-seq分析星形胶质细胞亚群变化，RNAscope检测C3+星形胶质细胞，Western blot检测GFAP和Vimentin。
Gal3敲除对疼痛行为和神经病理的影响
评估Gal3敲除对gp120Tg小鼠疼痛行为、神经元变性和神经炎症的作用。
von Frey测试机械性异常性疼痛，Hargreaves测试热痛敏，Fluoro-Jade C染色检测神经元变性，Western blot检测IL-1β、caspase-1、Wnt5a、Iba1等神经炎症标志物。
HIV患者脊髓样本中HIPAs的验证
验证HIPAs在HIV患者脊髓中是否也存在。
对HIV患者和非HIV对照者的脊髓尸检样本进行Gal3免疫荧光染色和Western blot，检测Gal3+星形胶质细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单核RNA测序 | 10X Genomics Chromium平台 | 10x Genomics | PN-1000075 |
| Chromium单细胞3′文库与凝胶珠试剂盒 | 10x Genomics | -- | |
| Hibernate A培养基 | BrainBits | HA | |
| B27添加剂 | ThermoFisher | 17504044 | |
| Glutamax添加剂 | Invitrogen | 35050-061 | |
| 青霉素-链霉素 | ThermoFisher | 15070063 | |
| DNase I | ThermoFisher | AM2224 | |
| 40微米滤网 | Fisher scientific | 08-771-1 | |
| 40微米Flowmi移液器吸头滤器 | Sigma-Aldrich | H13680-0040 | |
| 免疫荧光染色 | 抗Gal3抗体 | Santa Cruz | sc-23938 |
| 抗GFAP抗体 | Millipore | AB5541 | |
| 抗Iba1抗体 | Wako | 016-20001 | |
| 抗Vimentin抗体 | Abcam | ab137321 | |
| 抗NeuN抗体 | Millipore | ABN90 | |
| 抗Sox9抗体 | Sigma-Aldrich | ab5535 | |
| 抗vGlut1抗体 | Synaptic systems | 35 303 | |
| ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36930 | |
| Fluoro-Jade C染色 | Fluoro-Jade C即用型染色试剂盒 | Biosensis | TR-100-FJ |
| RNAscope原位杂交 | RNAscope多重荧光V2检测试剂盒 | Advanced Cell Diagnostics | -- |
| C3探针 | Advanced Cell Diagnostics | 417841 | |
| 含DAPI的VECTASHIELD HardSet抗荧光淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1500-10 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 抗切割IL-1β抗体 | Millipore | ab1413-I | |
| 抗pro-IL-1β抗体 | Cell Signaling Technology | 12242 | |
| 抗切割caspase-1抗体 | Cell Signaling Technology | 4199 | |
| 抗Wnt5a抗体 | Abcam | ab72583 | |
| 抗Iba1抗体 | Wako | AB_839506 | |
| 抗actin抗体 | Santa Cruz | sc-1616 | |
| Pierce增强化学发光试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 32106 | |
| gp120注射 | 重组gp120蛋白 | BEI Resources | HRP20082 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| snRNA-seq | 小鼠年龄4–5月龄，雄性，每组3只混合；核分离缓冲液成分及浓度；10X Genomics平台版本 阅读提示：Methods: Lumbar spinal cord dissection, Nucleus dissociation, 3’ single-nucleus RNA library construction |
| 免疫荧光染色 | 抗体稀释比例（Gal3 1:500, GFAP 1:500等）；固定时间24 h；切片厚度10–35 μm 阅读提示：Methods: Immunofluorescent (IF) staining |
| Gal3敲除小鼠构建 | gp120Tg小鼠背景；Gal3−/−小鼠来源（Jackson Laboratory #006338）；Gfap-Cre小鼠来源（#024098）；Lgals3-Flox小鼠来源 阅读提示：Methods: Animal |
| 疼痛行为学测试 | von Frey测试适应时间3天，每天2 h；纤维范围0.1–2.0 g；双盲设计；Hargreaves测试cutoff 20 s 阅读提示：Methods: Mechanical pain tests, Thermal hypersensitivity tests |
| Western blot | 上样量30 μg/孔；抗体稀释比例；ECL检测试剂 阅读提示：Methods: Western blotting analysis |
| gp120注射 | 注射剂量7 μL（15 ng/μL），每两天一次共3次；注射部位L5-L6椎间隙；注射速度约1 μL/3 s 阅读提示：Methods: Gp120 injection |