设计合成IRE1降解剂并筛选
获得能高效降解内源性IRE1的PROTAC分子
基于IRE1激酶配体Ex 91衍生物G1167，通过哌嗪出口向量连接不同长度和组成的连接子（烷基链和PEG链）以及VHL、CRBN、XIAP配体，合成约100个双价化合物库，利用高通量降解实验筛选，最终选定G6374。
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通过招募VHL的嵌合体化学诱导内质网应激传感器IRE1降解
Chemically-induced degradation of the endoplasmic-reticulum stress sensor IRE1 by a VHL-recruiting chimera.
实验完整度
高包含细胞系、重组蛋白体外泛素化、冷冻电镜结构、突变功能验证及细胞增殖实验等多层级证据。
主要模型
AMO1多发性骨髓瘤细胞系 KMS27多发性骨髓瘤细胞系 OPM2细胞系 HEK293T细胞系
重点核对
G6374浓度梯度（0.1、0.3、1 μM等）处理AMO1、KMS27细胞，免疫印迹检测IRE1降解 G6374（3 μM，2 h）处理AMO1细胞，免疫共沉淀检测IRE1 K48连接泛素化 体外泛素化反应：重组IRE1.KR、CRL2VHL复合物、E1/E2酶、泛素或甲基化泛素，加G6374 NanoBRET实验检测HEK293T细胞中过表达IRE1与VHL的相互作用及IRE1降解 细胞增殖实验：IRE1依赖性（OPM2、AMO1、KMS27）与非依赖性（U2OS、Colo201）细胞系，G6374浓度梯度处理
摘要
内质网（ER）跨膜蛋白IRE1通过激酶-核糖核酸酶和内支架活性缓解内质网应激。癌细胞常利用IRE1促进生长。一种IRE1-RNase抑制剂已进入临床试验；然而，近期工作发现癌症中存在显著的非酶性IRE1依赖性。为了完全破坏IRE1，我们描述了一种蛋白水解靶向嵌合体（G6374），它将IRE1激酶配体与结合泛素Cullin-RING连接酶（CRL）底物受体VHL的化合物偶联。G6374诱导IRE1与VHL之间稳定、协同的相互作用，驱动IRE1激酶结构域两个主要赖氨酸残基上的K48连接泛素化，并诱导蛋白酶体依赖性IRE1降解。冷冻电镜和突变研究表明2:2的IRE1:VHL三元复合物拓扑结构和关键相互作用特征，为未来设计提供信息。G6374阻断IRE1依赖性癌细胞的生长，无论其依赖模式如何，同时不影响IRE1非依赖性细胞。我们提供了基于VHL降解内质网跨膜蛋白的概念验证，推进了完全破坏IRE1的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过化学诱导IRE1蛋白降解来全面破坏IRE1功能，从而抑制无论依赖酶活性还是非酶功能的IRE1依赖性癌细胞生长？
- 核心机制
- G6374作为PROTAC，将IRE1激酶配体与VHL配体连接，诱导IRE1与VHL形成稳定协同的三元复合物，促进CRL2VHL对IRE1激酶结构域K704和K717等位点的K48连接多泛素化，进而通过蛋白酶体途径降解IRE1。
- 主要证据
- 在AMO1、KMS27等多发性骨髓瘤细胞系中，G6374诱导IRE1高效降解（DC50分别为0.04 μM和0.13 μM）；体外泛素化实验证实G6374依赖CRL2VHL直接催化IRE1多泛素化；冷冻电镜解析了2:2 IRE1:G6374:VHL三元复合物结构；突变实验验证了关键相互作用界面；细胞增殖实验显示G6374选择性抑制IRE1依赖性癌细胞生长。
- 研究意义
- 提供了基于VHL降解内质网跨膜蛋白的概念验证，为全面破坏IRE1以治疗癌症及其他疾病提供了新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证G6374诱导IRE1降解效果
比较G6374与已知IRE1降解剂CPD-2828的降解效率和速度
在AMO1和KMS27细胞中，用G6374或CPD-2828浓度梯度处理，免疫印迹检测IRE1蛋白水平，计算Dmax和DC50；并进行时间进程实验。
验证G6374选择性
评估G6374对IRE1的选择性，排除脱靶效应
用G6374（1 μM）对220种激酶进行SelectScreen激酶谱分析；对抑制率>90%的激酶在AMO1和KMS27细胞中进行免疫印迹验证；全局蛋白质组学比较G6374与对照化合物G2642处理的AMO1细胞。
验证降解机制依赖CRL2VHL和蛋白酶体
确认G6374诱导的IRE1降解通过CRL2VHL泛素化和蛋白酶体途径
在AMO1细胞中，使用E1抑制剂TAK-243、Neddylation抑制剂TAS4464、蛋白酶体抑制剂bortezomib、溶酶体抑制剂bafilomycin A1或chloroquine，以及p97/VCP抑制剂，处理后再加G6374，免疫印迹检测IRE1；在HCT116细胞中用siRNA敲低VHL，检测G6374诱导的IRE1降解。
检测IRE1泛素化及修饰位点
直接验证G6374诱导IRE1 K48连接多泛素化并鉴定主要修饰位点
在AMO1细胞中，用G6374处理，免疫沉淀内源性IRE1，免疫印迹检测K48连接泛素；体外泛素化反应使用重组IRE1.KR、CRL2VHL复合物、E1、E2、泛素或甲基化泛素，加G6374，通过免疫印迹和质谱分析泛素化位点和连接类型。
验证G6374诱导IRE1与VHL稳定结合
确认G6374促进IRE1与VHL形成稳定复合物
在AMO1细胞中免疫共沉淀内源性IRE1和VHL，加G6374及IRE1激酶抑制剂G5758竞争；NanoBRET实验在HEK293T细胞中过表达IRE1-NanoLuc和Halo-VHL，检测相互作用和降解；重组蛋白SEC、SPR和FP分析二元和三元相互作用。
解析三元复合物冷冻电镜结构
从原子水平揭示IRE1:G6374:VHL三元复合物的组装和相互作用界面
纯化重组IRE1:G6374:VCB复合物，BS3交联和CTAB处理后制备冷冻电镜样品，数据收集和处理，构建原子模型。
突变分析关键相互作用界面
验证G6374与IRE1及IRE1与VHL界面上的关键氨基酸残基对结合和降解的功能重要性
构建IRE1点突变体（L577D、V586D、A597D、L644D、L695D、E651A、H579A、E621A/E836A等），在HEK293T细胞中过表达，NanoBRET检测IRE1:VHL结合和IRE1降解，免疫沉淀检测K48泛素化。
评估G6374对癌细胞增殖的选择性抑制
检验G6374是否选择性抑制IRE1依赖性癌细胞生长，不受依赖模式影响
在IRE1依赖性（OPM2、AMO1、KMS27）和非依赖性（U2OS、Colo201）细胞系中，用G6374浓度梯度处理，Incucyte活细胞成像系统监测细胞融合度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-8226细胞系 | -- | -- |
| 细胞裂解 | 1X磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物 | Invitrogen | 78440 |
| MSD实验 | Read Buffer T | MSD | R92TC-1 |
| 免疫印迹 | NuPAGE LDS样品缓冲液 | Invitrogen | NP0007 |
| NuPAGE样品还原剂 | Invitrogen | NP0009 | |
| BCA蛋白测定 | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| iBLOT2系统 | Invitrogen | -- | |
| Azure 600蛋白质印迹成像系统 | Azure Biosystems | -- | |
| Odyssey CLx成像仪 | LI-COR | -- | |
| IRDye 800CW山羊抗兔IgG | LI-COR | 926-32211 | |
| IRE1α (14C10)兔单克隆抗体 | Cell Signaling | 3294 | |
| GAPDH (14C10)兔单克隆抗体 | Cell Signaling | 2118 | |
| K48连接特异性多泛素抗体 | Cell Signaling | 4289 | |
| VHL抗体 | Cell Signaling | 68547 | |
| 免疫沉淀 | AminoLink Plus固定化试剂盒 | Thermo Fisher | 44894 |
| 蛋白A/G琼脂糖珠 | Pierce | 20421 | |
| siRNA转染 | RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | 13778150 |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985062 | |
| NanoBRET实验 | ERN1 (IRE1)-NanoLuc融合载体 | Promega | NV1321 |
| HaloTag-VHL融合载体 | Promega | N2731 | |
| FuGENE HD转染试剂 | Promega | E2311 | |
| HaloTag NanoBRET 618配体 | Promega | G9801 | |
| NanoBRET Nano-Glo底物 | Promega | N1571 | |
| GloMax Discover微孔板阅读器 | Promega | GM3000 | |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA Superflow珠 | Qiagen | -- |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | -- | |
| Mono Q 10/100 GL | Cytiva | -- | |
| 体外泛素化实验 | UBE2D1 | Biotechne | E2-616-100 |
| UBE2D2 | Biotechne | E2-622-100 | |
| 泛素 | Biotechne | U-100H-10M | |
| 甲基化泛素 | Biotechne | U-502-01M | |
| NEDD8 | Biotechne | UL-812-500 | |
| 质谱 | Orbitrap Lumos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Dionex Ultimate 3000 RSLC | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| IonOpticks Aurora系列色谱柱 | IonOpticks | -- | |
| 荧光偏振 | ProxiPlate-384 F Plus | Revvity | 6008260 |
| FAM标记HIF-1α肽 | biotechne | 7287 | |
| EnVision多模式板阅读器 | PerkinElmer | -- | |
| 表面等离子共振 | Biacore S200 | -- | -- |
| Xantec SAHC 200 M芯片 | Xantec | -- | |
| 冷冻电镜 | BS3 | Thermo Scientific | A39266 |
| UltrAuFoil 25 nm R1.2/1.3 300目载网 | Quantifoil | -- | |
| Vitrobot Mk IV | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Titan Krios G2 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞增殖实验 | Incucyte活细胞成像系统 | Sartorius | S3 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| G6374诱导IRE1降解的浓度和时间 | 细胞系（AMO1、KMS27）、G6374浓度梯度、处理时间（如17小时或时间进程）、免疫印迹检测 阅读提示：Methods中免疫印迹部分及图1b、补充图1b、1c |
| G6374诱导IRE1与VHL相互作用 | NanoBRET实验条件：HEK293T细胞、IRE1-NanoLuc和Halo-VHL转染、G6374浓度梯度、处理2小时 阅读提示：Methods中NanoBRET实验部分及图2b、2c |
| 体外泛素化反应 | 重组蛋白浓度（IRE1.KR 0.2 μM、G6374 0.2 μM、VHL:EloB:EloC 0.2 μM、CUL2-RBX1 0.2 μM、NAE1:UBA3 0.1 μM、UBE2M 1 μM、NEDD8 3 μM、UBE1 1 μM、UBE2R1 5 μM、泛素或甲基化泛素500 μM）、缓冲液组成、时间点 阅读提示：Methods中体外泛素化实验部分及图1i-1l |
| 冷冻电镜样品制备 | 复合物浓度0.2 mg/mL、BS3交联500 μM 60分钟、CTAB 0.005%、载网类型、冷冻条件 阅读提示：Methods中冷冻电镜网格制备部分及补充图3 |
| 细胞增殖实验 | 细胞系（OPM2、AMO1、KMS27、U2OS、Colo201）、接种密度（5000或2000 cells/well）、G6374浓度梯度、Incucyte监测频率 阅读提示：Methods中细胞融合度和活力实验部分及图6 |