全基因组CRISPR/Cas9筛选alpelisib合成致死靶点
鉴定与PI3K抑制剂alpelisib协同阻断EBVaGC增殖的基因
在稳定表达Cas9的YCCEL1细胞中转导Brunello sgRNA文库，经嘌呤霉素筛选后，分别用0.5 μM alpelisib或DMSO培养14天，PCR扩增sgRNA并测序，STARS算法分析差异sgRNA丰度。
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CTLH泛素连接酶底物ZMYND19和MKLN1在溶酶体膜上负调控mTORC1
The CTLH ubiquitin ligase substrates ZMYND19 and MKLN1 negatively regulate mTORC1 at the lysosomal membrane.
实验完整度
高全基因组CRISPR筛选、多种胃癌细胞系、MAEA敲除/回补、蛋白质组学、代谢组学、LysoIP、共免疫沉淀及结构域突变体功能验证
主要模型
YCCEL1 EBVaGC细胞系 SNU-719 EBV阳性胃癌细胞系 HEK-293T细胞系 HGC-27、SNU-1、SNU-16等胃癌细胞系
重点核对
CRISPR筛选：Brunello sgRNA文库感染复数0.3，0.5 μM alpelisib或DMSO处理14天，生物三重复，STARS算法q<0.05 MAEA敲除验证：YCCEL1等细胞系中sgRNA敲除，免疫印迹检测MAEA蛋白缺失，MAEA cDNA回补 rescue 存活 ZMYND19/MKLN1双敲除 rescue：ZMYND19和MKLN1单独敲除不 rescue，双敲除显著 rescue alpelisib处理的MAEA敲除细胞存活 mTORC1活性检测：免疫印迹检测S6K T389和4E-BP1 S65磷酸化，氨基 酸饥饿50分钟再刺激10分钟 溶酶体共定位与LysoIP：TMEM192-HA LysoIP，免疫印迹检测LAMP1富集及ZMYND19/MKLN1共纯化
摘要
大多数EB病毒相关胃癌（EBVaGC）携带激活磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）以驱动下游代谢信号的非同义突变。为了解此背景下PI3K/mTOR通路失调，我们进行了全人基因组CRISPR/Cas9筛选，寻找与PI3K拮抗剂alpelisib协同阻断EBVaGC增殖的基因。羧基端到LisH（CTLH）E3连接酶的多个亚基，包括催化亚基MAEA，位列筛选前列。CTLH在酵母中负调控糖异生，但在高等生物中并非如此。CTLH底物MKLN1和ZMYND19在MAEA敲除后高度积累，彼此结合并与溶酶体外膜结合，抑制mTORC1。ZMYND19和MKLN1并不干扰mTORC1的溶酶体招募，而是阻断mTORC1与Rheb的相互作用以及与mTORC1底物S6和4E-BP1的相互作用。因此，CTLH使细胞能够通过泛素/蛋白酶体途径在溶酶体膜上快速调节mTORC1活性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在PI3K激活的EBVaGC中，哪些因子支持PI3K/mTORC1信号，其抑制可与alpelisib协同阻断肿瘤细胞增殖？
- 核心机制
- CTLH E3连接酶通过泛素/蛋白酶体途径降解ZMYND19和MKLN1；CTLH活性丧失后，ZMYND19和MKLN1在溶酶体外膜积累，阻断mTORC1与Rheb及TOS motif底物S6K和4E-BP1的结合，从而抑制mTORC1激活。
- 主要证据
- 全基因组CRISPR筛选鉴定CTLH亚基为alpelisib合成致死靶点；MAEA敲除增加ZMYND19/MKLN1蛋白稳定性；LysoIP和共定位显示ZMYND19/MKLN1与溶酶体关联；共免疫沉淀显示MAEA敲除或ZMYND19/MKLN1过表达破坏Raptor与Rheb、S6K和4E-BP1的相互作用；ZMYND19/MKLN1双敲除 rescue 细胞存活。
- 研究意义
- 研究提示CTLH可能成为EBVaGC及其他依赖PI3K/mTOR信号通路的肿瘤的治疗靶点，CTLH抑制与低剂量PI3K抑制剂联用值得进一步研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CTLH亚基MAEA敲除与alpelisib的合成致死效应
验证筛选结果并确定MAEA在胃癌细胞存活中的作用
在YCCEL1、SNU-719、HGC-27、SNU-1、SNU-16和HEK-293T细胞中敲除MAEA，单独或联合alpelisib处理，计数活细胞；用MAEA cDNA回补验证on-target效应；用流式细胞术分析细胞周期。
MAEA敲除对代谢通路的影响分析
探究MAEA缺失是否改变胃癌细胞代谢，解释其与alpelisib协同作用的机制
对MAEA敲除或对照YCCEL1细胞在DMSO或0.5 μM alpelisib处理30小时后进行靶向LC-MS/MS代谢组分析，检测2-NBDG葡萄糖摄取和Seahorse耗氧率/胞外酸化率。
RNAseq和蛋白质组学鉴定CTLH底物
寻找介导MAEA敲除效应、调控mTORC1的底物蛋白
对MAEA敲除与对照YCCEL1进行RNAseq和全细胞蛋白质组分析，免疫印迹验证ZMYND19和MKLN1蛋白水平及半衰期。
ZMYND19/MKLN1对mTORC1活性和细胞存活的功能验证
验证ZMYND19和MKLN1是否介导MAEA敲除对mTORC1的抑制及合成致死效应
在YCCEL1中单独或联合敲除ZMYND19和MKLN1，检测alpelisib处理后的活细胞数；在HEK-293T MKLN1/ZMYND19双敲除细胞中电转IVT mRNA表达ZMYND19、MKLN1或突变体，免疫印迹检测S6K和4E-BP1磷酸化。
ZMYND19/MKLN1溶酶体定位与相互作用分析
确定ZMYND19和MKLN1是否定位于溶酶体并相互作用
用GFP-MAEA和LysoTracker红染进行活细胞共聚焦成像；建立TMEM192-HA LysoIP，免疫印迹检测ZMYND19/MKLN1；免疫荧光共定位ZMYND19与LAMP2；Proteinase K保护实验检测膜定位；共免疫沉淀分析蛋白相互作用和结构域。
mTORC1抑制机制解析：Rheb结合与TOS motif底物
确定ZMYND19/MKLN1抑制mTORC1的分子步骤
在MAEA敲除或ZMYND19/MKLN1过表达细胞中，用共免疫沉淀检测Raptor与Rheb、S6K、4E-BP1的相互作用；用共聚焦显微镜检测mTOR与LAMP2共定位；用Raptor-Rheb融合蛋白和TSC2敲除验证机制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 阿培利司 | Cayman Chemical | 16986 |
| ML-210 | Cayman Chemicals | 23282 | |
| 雷帕霉素 | Selleckchem | AY-22989 | |
| Ferrostatin-1 | Sigma-Aldrich | SML0583 | |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | Invitrogen | P03566 |
| 葡萄糖摄取检测 | 2-NBDG | ThermoFisher | N13195 |
| 嘌呤霉素追踪实验 | 嘌呤霉素 | Thermofisher | A1113803 |
| mTOR抑制 | Torin 1 | MedChemExpress | HY-13003 |
| HEK-293T转染 | Effectene转染试剂 | Qiagen | 301425 |
| PEI试剂 | Sigma | 919012 | |
| 免疫沉淀 | 抗V5标签磁珠 | MBL | -- |
| 抗Flag M2抗体 | Sigma | F1804 | |
| Pierce蛋白A/G磁珠 | ThermoFisher | 88803 | |
| Pierce抗HA磁珠 | ThermoFisher | 88837 | |
| GFP-Trap琼脂糖珠 | PGTlabs | -- | |
| 免疫印迹 | 磷酸化Akt (Ser473) (D9E) 抗体 | Cell Signaling Technology | 4060S |
| 磷酸化Akt (Thr308) (244F9) 抗体 | Cell Signaling Technology | 4056S | |
| 磷酸化p70 S6激酶 (Thr389) (108D2) 抗体 | Cell Signaling Technology | 9234S | |
| 磷酸化4E-BP1 (Ser65) 抗体 | Cell Signaling Technology | 9451S | |
| 抗MAEA抗体 | R&D Systems | AF7288 | |
| 兔源抗ZMYND19抗体 | Millipore Sigma | HPA020642 | |
| 抗MKLN1 (C-12) 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-398956 | |
| 质粒转染 | pLentiGuide-Puro载体 | Addgene | 52963 |
| 体外转录 | mMACHINE T7转录试剂盒 | Thermofisher | AM1344 |
| mRNA电转 | Neon转染系统 | Thermo Fisher | -- |
| 活细胞成像 | 溶酶体追踪染料 | Invitrogen | L7528 |
| Seahorse分析 | Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | 103015-100 |
| 蛋白质组分析 | TMT 10标等压标记试剂 | Thermo Fisher Scientific | 90110 |
| Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce高pH反相肽段分级试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 84868 | |
| CRISPR筛选 | 血液和细胞培养DNA大提试剂盒 | Qiagen | -- |
| 细胞培养 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR/Cas9全基因组筛选 | 细胞模型YCCEL1、Brunello文库感染复数0.3、alpelisib浓度0.5 μM、处理14天、生物三重复、STARS q<0.05 阅读提示：Methods 'CRISPR-Cas9 screen'及Fig. 1d |
| MAEA敲除与alpelisib合成致死验证 | 细胞系（YCCEL1、SNU-719、HGC-27、SNU-1、SNU-16、HEK-293T）、alpelisib 0.5 μM、处理5-7天、活细胞计数方法 阅读提示：Results 'CTLH inhibition causes metabolic remodeling'及Fig. 2b-d、Supplementary Fig. S2 |
| ZMYND19/MKLN1双敲除rescue实验 | sgRNA组合、alpelisib 0.5 μM处理7天、活细胞比值、免疫印迹验证敲除效率 阅读提示：Results 'ZMYND19 and MKLN1 form a complex that negatively regulates mTOR'及Fig. 3g |
| mTORC1活性检测（氨基酸饥饿/刺激） | 无氨基酸EMEM饥饿50分钟、100× MEM氨基酸1:100刺激10分钟、S6K T389和4E-BP1 S65磷酸化免疫印迹 阅读提示：Methods 'Amino acids starvation and stimulation'及Fig. 3b、Supplementary Fig. 11a |
| 溶酶体免疫纯化（LysoIP） | TMEM192-HA稳定表达、35 million细胞、anti-HA磁珠、LAMP1富集验证、ZMYND19/MKLN1检测 阅读提示：Methods 'Lysosomal immunopurification'及Fig. 4c-e |
| 共免疫沉淀检测Raptor-Rheb相互作用 | HEK-293T对照或MAEA敲除单克隆、Rheb-V5稳定表达、Raptor-GFP转染6 μg、GFP-Trap、免疫印迹 阅读提示：Methods 'HEK-293T transfection'及Fig. 7d-e |
| 代谢组分析 | MAEA敲除YCCEL1、alpelisib 0.5 μM处理30小时、n=6、LC-MS/MS靶向代谢物 profiling 阅读提示：Methods 'Targeted metabolite profiling'及Fig. 2g-i |
| Seahorse代谢通量分析 | YCCEL1 50,000细胞/孔、DMSO或0.5 μM alpelisib处理8小时、oligomycin 1.5 μM、FCCP 0.5 μM、antimycin 0.5 μM 阅读提示：Methods 'Seahorse analysis'及Fig. 2k-l |