建立轴向限制细胞死亡模型
验证可控轴向限制是否引起细胞死亡及其死亡方式
用PDMS微柱或微球加不锈钢配重对HeLa、HT1080细胞施加3 µm轴向限制，以PI摄取监测细胞死亡，并与20 µm、10 µm及缺氧、营养剥夺条件比较
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机械限制通过线粒体功能障碍诱导铁死亡
Mechanical confinement induces ferroptosis through mitochondrial dysfunction.
实验完整度
高含HeLa/HT1080细胞、原代软骨细胞、去核胞质体、重组蛋白相分离及OA患者组织等多层级证据，并有功能与机制验证
主要模型
HeLa细胞 HT1080人纤维肉瘤细胞 人原代软骨细胞 骨关节炎患者软骨组织
重点核对
轴向限制高度3 µm（对照20 µm或10 µm），HeLa细胞限制9 h后检测细胞死亡 铁死亡抑制剂DFOM 100 µM、Fer-1 1 µM、Lip-1 0.5 µM预处理后检测PI阳性细胞比例 cPLA2 shRNA敲低及抑制剂CAY10650 150 nM对脂质ROS、ARA水平和细胞死亡的影响 Drp1 shRNA敲低及Drp1-K38A、A395D/R403C/C431Y突变对线粒体碎片化和细胞死亡的影响 MitoTEMPO 10 µM或EtdBr去除mtDNA对总ROS、脂质ROS和细胞死亡的影响
摘要
高密度环境中的细胞暴露于波动的机械力。虽然细胞可以激活皮层迁移机制以逃离不利的压缩应力，但对运动性较低的细胞以及长期广泛限制的后果尚待揭示。在此，我们证明轴向限制产生的核变形触发了一种特定形式的调节性细胞死亡——铁死亡。我们表明轴向限制被细胞核感知，并导致Drp1依赖的线粒体碎片化和线粒体ROS积累。同时，我们检测到cPLA2转位至线粒体。这些线粒体ROS积累和花生四烯酸产生共同导致脂质过氧化并引发铁死亡。有趣的是，我们在骨关节炎——一种与机械超负荷和炎症密切相关的疾病中，发现了限制诱导的铁死亡特征，包括cPLA2的线粒体定位和高ROS。总之，我们的发现揭示了细胞核和线粒体在将机械限制与细胞死亡联系起来中的关键作用，强调了Drp1和cPLA2在限制诱导的铁死亡中的协同作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 持续轴向机械限制如何影响贴壁、低运动性细胞的命运，其分子机制是什么。
- 核心机制
- 轴向限制经细胞核感知，诱导Drp1依赖的线粒体碎片化和mtROS积累，同时触发Ca2+依赖的cPLA2线粒体转位及ARA生成；mtROS与ARA协同驱动脂质过氧化和铁死亡，二者互不依赖。
- 主要证据
- HeLa与HT1080细胞在3 µm轴向限制下出现PI摄取、DHE和BODIPY-C11脂质ROS升高、COX2 mRNA升高，且被铁死亡抑制剂逆转；cPLA2敲低或抑制剂、Drp1敲低或突变、MitoTEMPO及ρ0细胞均减少脂质ROS和细胞死亡；去核胞质体丧失cPLA2转位和Drp1液滴形成；OA软骨组织显示更高ROS及cPLA2与Tom20部分共定位。
- 研究意义
- 揭示细胞核与线粒体连接机械限制与细胞死亡的作用，提示该机制可能与骨关节炎等机械应力及炎症相关疾病有关。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定铁死亡特征
判断限制诱导的死亡是否为铁死亡而非焦亡或坏死性凋亡
检测总ROS、脂质ROS、COX2 mRNA，并用铁死亡抑制剂、焦亡和坏死性凋亡相关抑制剂及标志物进行验证
验证cPLA2线粒体转位及Ca2+依赖性
明确cPLA2在限制下是否转位至线粒体并产生ARA
活细胞成像cPLA2-eGFP与Mito Red共定位，ELISA检测ARA，shRNA敲低或CAY10650抑制cPLA2，并用去核胞质体和C2/PL截短体、BAPTA-AM验证
验证Drp1依赖的线粒体碎片化与mtROS
确定线粒体碎片化及mtROS在限制诱导铁死亡中的作用
Tom20-mCherry、TMRM、Mito-roGFP成像线粒体形态、膜电位和mtROS；shRNA敲低Drp1、过表达Drp1-K38A，或用MitoTEMPO、EtdBr、rotenone/antimycin A干预
验证Drp1液滴形成及相分离特性
探究限制下Drp1时空激活形式
CRISPR-Cas9敲入eGFP-Drp1，活细胞成像Drp1斑点与线粒体共定位，SIM超分辨观察，optoDroplet系统和体外纯化蛋白相分离实验，疾病相关点突变回补实验
验证mtROS与ARA协同及临床相关性
确认两条通路的协同关系并在骨关节炎样本中验证
分别或联合加入H2O2与ARA模拟ROS和cPLA2激活，检测细胞死亡；分离人软骨细胞进行限制实验，并比较正常与OA软骨组织ROS及cPLA2/Tom20共定位
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞死亡与铁死亡特征
验证线粒体功能与形态
验证蛋白相分离与凝聚
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Corning | 10-013-CRVC |
| 胎牛血清 | PAN-Biotech | P30-3302 | |
| 青霉素和链霉素 | Macgene | CC004 | |
| 纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F1056-5MG | |
| 玻璃底培养皿 | Cellvis | D35-10-1-N | |
| 无CO2依赖DMEM | Gibco | 18045-088 | |
| 原代软骨细胞培养 | 最低必需培养基α改良型 | HyClone | SH30265.01 |
| 质粒构建与转染 | MultiF无缝组装试剂盒 | ABclonal | RK21020 |
| Opti-MEM培养基 | Invitrogen | 31985-070 | |
| Neofect DNA转染试剂 | -- | TF20121201 | |
| 细胞限制 | 微球间隔物 | Bangs Laboratories | -- |
| 聚二甲基硅氧烷 | Dow Corning | Slygard 184 | |
| pLL-PEG无粘附涂层 | SuSoS | -- | |
| 细胞死亡检测 | 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | P4170-10MG |
| 总ROS检测 | 二氢乙锭 | Beyotime | S0063 |
| 脂质ROS检测 | BODIPY-C11 581/591探针 | Abclonal | RM02821 |
| Western blot | 兔抗Drp1抗体 | Abcam | EPR19274 |
| 兔抗剪切N端GSDMD抗体 | Abcam | EPR20829-408 | |
| 兔抗GSDME抗体 | Abcam | EPR19859 | |
| 兔抗MLKL抗体 | Abcam | EPR9514 | |
| 兔抗GAPDH抗体 | Abcam | EPR16891 | |
| 鼠抗β-actin抗体 | Abcam | ab8226 | |
| 兔抗Drp1抗体 | Abclonal | A21968 | |
| 兔抗全长GSDMD抗体 | Abclonal | A17308 | |
| 兔抗cPLA2抗体 | Abclonal | A0394 | |
| 免疫荧光 | 兔抗Tom20抗体 | Abclonal | A19403 |
| Western blot | 鼠抗α-tubulin抗体 | Abclonal | AC012 |
| 免疫荧光 | 鼠抗cPLA2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-454 |
| Western blot | 抗鼠HRP偶联二抗 | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 |
| 抗兔HRP偶联二抗 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| 兔抗HIF1α抗体 | Novus Biologicals | NB100-479 | |
| 免疫荧光 | 抗鼠Alexa Fluor 488二抗 | ThermoFisher Scientific | A-21202 |
| 抗兔Alexa Fluor 555偶联二抗 | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| 药物处理 | Z-VAD-FMK | Selleckchem | S7023 |
| 去铁胺 | Selleckchem | S5742 | |
| Liproxstatin-1 | Selleckchem | S7699 | |
| Ferrostatin-1 | Selleckchem | S7243 | |
| MitoTEMPO | Selleckchem | S9733 | |
| Trolox | Abcam | ab120747 | |
| FCCP | MedChemExpress | HY-100410 | |
| CAY10650 | MedChemExpress | HY-10801 | |
| BAPTA-AM | MedChemExpress | HY-100545 | |
| ROS检测 | MitoSOX Red | MedChemExpress | HY-D1055 |
| 药物处理 | 鱼藤酮 | MedChemExpress | HY-B1756 |
| 花生四烯酸 | MedChemExpress | HY-109590 | |
| 缺氧检测 | Image-iT绿色缺氧试剂 | ThermoFisher Scientific | I14834 |
| 线粒体染色 | MitoTracker Red CMXRos | ThermoFisher Scientific | M7512 |
| MitoTracker Green FM | ThermoFisher Scientific | M7514 | |
| 线粒体膜电位检测 | 四甲基罗丹明甲酯 | ThermoFisher Scientific | T668 |
| 免疫荧光封片 | 含DAPI的Prolong Diamond抗淬灭封片剂 | ThermoFisher Scientific | P36962 |
| 药物处理 | EUK134 | TargetMol | T6495 |
| N-乙酰半胱氨酸 | Shanghai Yuanye Bio-Technology | S20137 | |
| 过氧化氢 | Aladdin | H112515 | |
| Western blot | SDS-PAGE上样缓冲液 | Beyotime | P0015A |
| qRT-PCR | Trizol试剂 | Life Technologies | 15596026 |
| Transcript一步法gDNA去除与cDNA合成试剂盒 | Transgene | AT311-02 | |
| SYBR Green快速qPCR混合液 | ABclonal | RK21203 | |
| ARA检测 | 花生四烯酸ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-0051 |
| 细胞去核 | 细胞松弛素D | Sigma-Aldrich | C2618-200UL |
| GeneSpeed微量离心机 | Gene Company Limited | 1524 | |
| ρ0细胞制备 | 溴化乙锭 | Generay | GA328 |
| 尿苷 | HARVEYBIO | NL1121 | |
| 动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒 | Solarbio | D1700 | |
| 原子力显微镜 | Bioscope Resolve原子力显微镜 | Bruker | -- |
| HA_FM无尖端硅探针 | ScanSens | -- | |
| 细胞培养 | 玻璃底培养皿 | Cellvis | D35-20-1-N |
| eGFP-Drp1敲入 | 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P8833 |
| 蛋白纯化 | Ni-IDA柱 | Smart-Lifesciences | -- |
| Superose 6 Increase 10/300层析柱 | GE Healthcare | -- | |
| 相分离实验 | 盖玻片 | Fisherbrand | 12541016 |
| 超分辨成像 | PK Mito Orange线粒体探针 | GENVIVO | PKMO-2 |
| 细胞培养 | 培养皿 | Corning | 430165 |
| 细胞限制 | 硅胶管 | Agilent | 5065-9978 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 轴向限制细胞死亡模型 | 限制高度（3 µm与20 µm/10 µm对照）、限制持续时间、PI浓度5 µg/mL、独立视野数n=8及生物学重复N=3 阅读提示：Methods的Cell confinement与Microscopy imaging of cell death小节；Fig. 1a、b及Supplementary Fig. 1 |
| 铁死亡抑制剂干预 | DFOM 100 µM、Fer-1 1 µM、Lip-1 0.5 µM的预处理时间与溶剂对照DMSO 阅读提示：Fig. 1h、i图注及Antibody and reagents小节 |
| cPLA2敲低与抑制 | shcPLA2α序列、CAY10650 150 nM、限制时间（3 h共定位、5–6 h ROS与ARA、9 h死亡） 阅读提示：Methods的Generation of knock-down and knock-out cells小节；Fig. 2及Supplementary Fig. 3g |
| Drp1敲低与突变回补 | shDrp1序列、Drp1-K38A及A395D/R403C/C431Y突变构建、限制90 min形态检测与6 h死亡检测 阅读提示：Methods的Plasmid construction与Generation of knock-down and knock-out cells小节；Fig. 4、Fig. 5i–k |
| mtROS干预与ρ0细胞 | MitoTEMPO 10 µM、EtdBr 450 ng/ml培养10天、rotenone/antimycin A处理及检测时间点 阅读提示：Methods的Generation of mtDNA-depleted ρ0 cells小节；Fig. 3g–m及Supplementary Fig. 5 |
| 体外相分离实验 | Drp1-eGFP浓度20 µM、NaCl 200 mM、dextran 8%、缓冲液pH 8.0 阅读提示：Methods的In vitro phase transition assay小节；Fig. 5f、g |
| 人软骨与OA组织验证 | 软骨细胞来源与伦理批号2013003、0.2% II型胶原酶消化4 h、DHE 50 µM与BODIPY-C11 20 µM染色条件、正常与OA配对样本 阅读提示：Methods的Isolation and culture of human chondrocytes与Immunofluorescence of human cartilage samples小节；Fig. 7 |