构建并验证猎隼化EPAS1敲入小鼠
建立携带青藏高原猎隼适应性EPAS1变异的动物模型，为研究低氧下糖脂代谢共调控提供体内体系。
利用CRISPR-Cas9将小鼠EPAS1第5外显子AC编辑为GT，使第162位氨基酸由Val变为Thr；通过PCR和Sanger测序对敲入小鼠及子代进行基因型鉴定，并检查潜在脱靶。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
模拟高原低氧环境生理反应中糖脂代谢的稳态维持
Homeostasis of glucose and lipid metabolism during physiological responses to a simulated hypoxic high altitude environment.
实验完整度
高含基因敲入小鼠模型、体外Co-IP/RNAi、肝脏转录组与代谢组、野生猎隼血浆验证及急性低氧存活分析，涵盖功能与机制验证。
主要模型
EPAS1V162T/V162T 基因敲入（猎隼化）雄性小鼠 EPAS1+/+ 野生型 C57BL/6J 雄性小鼠 Hela 与 293T 细胞系 青藏高原野生猎隼血浆样本
重点核对
小鼠基因型：EPAS1V162T/V162T 纯合突变作为实验组，EPAS1+/+ 野生型作为对照 慢性低氧条件：10% O2；急性低氧条件：4% O2 RER 测定：每组 n=9–11，禁食并维持30°C 3小时，取最低耗氧时3个连续RER均值 GTT：腹腔注射葡萄糖 2 g kg-1 体重，于0、15、30、60、120 min 检测血糖 生存分析：突变型 n=30、野生型 n=30，梯度低氧预适应后暴露于4% O2
摘要
稳态有助于在外界波动下维持生理过程。在有氧生物中，稳态主要由葡萄糖和脂质代谢供能，并以氧气作为代谢底物。因此，缺氧可触发体内稳态失衡。生活在高海拔低氧条件下的动物如何维持两种代谢之间的稳态仍 largely 未知。在此，我们基于从青藏高原（QTP）猎隼（Falco cherrug）中鉴定出的适应性EPAS1遗传变异，建立了一个‘猎隼化’小鼠模型。我们发现，在慢性低氧下，雄性猎隼化小鼠肝脏中葡萄糖和脂质代谢之间的稳态得以维持。这种稳态由遗传因素和行为可塑性介导，导致即使在急性低氧下其存活率也高于野生型小鼠。我们的研究强调了代谢稳态维持对于在极端环境中生存的关键作用，并为相关代谢疾病的治疗提供了潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 高海拔低氧条件下动物如何维持葡萄糖与脂质代谢之间的稳态，以及该稳态是否有助于低氧耐受与生存。
- 核心机制
- 猎隼来源的EPAS1 V162T变异降低EPAS1与ARNT的相互作用、增强与pVHL的相互作用，并下调EPAS1主导转录本表达，从而减弱EPAS1功能，协调糖脂代谢基因表达网络；行为可塑性（如呼吸率、摄食和活动调整）也正向贡献RER维持。
- 主要证据
- 猎隼化小鼠在低氧下维持较高且稳定的RER、肝脏葡萄糖恢复及FFA和TG水平低于野生型；Co-IP显示EPAS1突变体与ARNT结合减弱、与pVHL结合增强；RNAi敲低EPAS1下调脂解和脂合成基因；野生猎隼纯合子血浆碳水化合物较高、FFA较低；突变小鼠在4% O2下存活率显著高于野生型。
- 研究意义
- 研究强调代谢稳态维持对极端环境生存的关键作用，并提供EPAS1作为相关代谢疾病潜在治疗靶点的可能方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估低氧下能量底物利用与糖脂稳态
比较突变型与野生型小鼠在常氧和低氧下的能量底物利用模式及糖脂代谢稳态。
使用TSE代谢笼系统测定常氧和低氧处理前后的RER；对肝脏样本进行广泛靶向代谢组/脂质组UPLC-MS/MS分析，并在低氧D3进行葡萄糖耐量试验。
解析EPAS1变异调控糖脂代谢的分子机制
验证EPAS1 V162T变异对蛋白互作、转录本表达及糖脂代谢基因网络的影响。
在Hela和293T细胞中共表达myc-EPAS1与flag-ARNT或flag-pVHL进行Co-IP和Western blot；利用肝脏RNA-seq和Iso-seq比较突变型与野生型转录本及差异表达基因；在293T细胞中RNAi敲低EPAS1后qPCR检测脂代谢基因。
验证野生猎隼的代谢特征
检验猎隼化小鼠中观察到的糖脂代谢特征是否也存在于携带相同EPAS1等位基因的野生猎隼。
采集青藏高原野生猎隼血浆，按EPAS1基因型分为纯合突变与杂合突变，进行广泛靶向代谢组/脂质组UPLC-MS/MS分析。
评估行为可塑性及其对代谢稳态的贡献
分析低氧下呼吸率、摄食、排便和运动行为变化，并量化行为、环境和遗传对RER的贡献。
使用MouseOx Plus系统测定动脉血氧饱和度和呼吸率；记录摄食量、粪便产量和通过EthoVision XT16分析的运动活动；构建结构方程模型评估遗传、环境、基因-环境互作和行为对RER的影响。
评估低氧耐受与生存获益
检验糖脂代谢稳态维持是否带来体重恢复、氧化应激降低和急性低氧下生存优势。
每日测量常氧和低氧下体重变化；分析ROS代谢通路基因表达；在梯度低氧预适应后暴露于4% O2，用MouseOx Plus监测心率并进行Kaplan-Meier生存分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
构建与验证基因敲入小鼠
分析转录组与基因调控网络
评估行为与生理反应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠饲养 | 啮齿动物饲料 | Beijing Keao Xieli Feed Co., Ltd. | 1016706476803973120 |
| DNA提取 | 蛋白酶K | Macklin | -- |
| 2-丙醇生物试剂 | Sigma | -- | |
| 乙醇 | Sigma | -- | |
| 无DNase/RNase水 | Solarbio | -- | |
| 低氧暴露 | 常压低氧舱 | Attendor | -- |
| RER测定 | Labmaster代谢笼系统 | TSE | -- |
| 血细胞比容测定 | EDTA抗凝真空采血管 | BD Biosciences | -- |
| Mindray BC-2600Vet血常规分析仪 | Mindray | -- | |
| 运动活动分析 | 摄像机 | Hikvison | -- |
| EthoVision XT16视频追踪系统 | Noldus | -- | |
| 血氧与呼吸率测定 | MouseOx Plus脉搏血氧仪 | STARR Life Science | -- |
| 葡萄糖耐量试验 | 葡萄糖 | Sigma | -- |
| 血糖仪 | Roche | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 氯仿 | Sinopharm | -- | |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| Dulbecco磷酸盐缓冲液 | Gibco | -- | |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA | Gibco | -- | |
| 质粒构建 | PrimeScript逆转录酶 | Takara | -- |
| pCDNA3.1-EGFP载体 | ZOMANBIO | ZK430 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Western blot | PVDF膜 | GE Healthcare | -- |
| 抗GFP抗体 | Abcam | ab183734 | |
| β-肌动蛋白单克隆抗体 | Gene-Protein Link | P01L03 | |
| 山羊抗兔IgG-HRP | Gene-Protein Link | P03S02S | |
| 山羊抗小鼠IgG-HRP | Gene-Protein Link | P03S01S | |
| Western blot检测 | ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- |
| Co-IP质粒构建 | pCDNA3.1-3×Myc-C载体 | MiaoLingBio | P14395 |
| pCDNA3.1-FLAG-C载体 | MiaoLingBio | P11108 | |
| Co-IP | Mag c-Myc IP/Co-IP缓冲液-1 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Pierce磁珠c-Myc标签IP/Co-IP试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Co-IP Western blot | Myc标签(71D10)兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2278S |
| DYKDDDDK标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2368S | |
| β-微管蛋白单克隆抗体 | Gene-Protein Link | P01L06 | |
| RNAi转染 | Lipofectamine RNAiMAX试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | TB Green Premix Ex Taq II试剂盒 | Takara | -- |
| LightCycler 480系统 | Roche | -- | |
| 代谢组/脂质组UPLC-MS/MS | Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱 | Waters | -- |
| 脂质组UPLC-MS/MS | Thermo Accucore™ C30色谱柱 | Thermo | -- |
| 代谢组/脂质组UPLC-MS/MS | ExionLC AD超高效液相色谱仪 | -- | -- |
| QTRAP串联质谱仪 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 猎隼化小鼠构建 | 遗传背景C57BL/6J；编辑位点EPAS1第5外显子第162位Val→Thr；sgRNA序列；实验用8–9周龄雄性小鼠；两个独立品系用途 阅读提示：Methods“Generation of falconized mice”及Fig. 1a、Supplementary Fig. 1 |
| 慢性与急性低氧暴露 | 慢性低氧10% O2、急性低氧4% O2；常氧21% O2；低氧舱氧浓度控制精度±0.1% 阅读提示：Methods“Hypoxic chamber for mouse maintenance” |
| RER测定 | 各时间点每组样本量D2 10 vs 10、D3 10 vs 10、D4 10 vs 9、D7 11 vs 10；禁食和30°C 3小时；取最低耗氧时3个连续RER均值；气流速度0.7 L/min和0.39 L/min 阅读提示：Methods“Measurements of the respiratory exchange ratio”及Fig. 1b–d |
| 葡萄糖耐量试验 | 禁食过夜；腹腔注射葡萄糖2 g kg-1体重；每组n=9；检测时间0、15、30、60、120分钟；常氧D0与低氧D3 阅读提示：Methods“Glucose tolerance test in mice”及Fig. 2b |
| 肝脏代谢组与脂质组 | 时间点D0、D2、D3、D4、D7，每组n=8；取20 mg肝脏； hydrophilic和hydrophobic提取溶剂；QC样本每10次检测后分析；CV稳定性标准 阅读提示：Methods“Profiling of metabolites from mouse liver samples using UPLC-MS/MS”及Supplementary Figs. 42–44 |
| Co-IP与RNAi | Hela或293T细胞；myc-EPAS1与flag-ARNT或flag-pVHL共转染48小时；EPAS1 siRNA转染48小时；抗体货号 阅读提示：Methods“Co-IP experiments”和“EPAS1 expression knockdown by RNAi”及Fig. 3a |
| 急性低氧生存分析 | 突变型n=30、野生型n=30；梯度预适应21%、15%、10% O2各10分钟；4% O2暴露；心率信号停止判定死亡 阅读提示：Methods“Estimation of survival rate under acute hypoxia”及Fig. 5c |
| 野生猎隼血浆代谢组 | 6只纯合子与4只杂合子；血浆200 µl EDTA抗凝；显著性阈值VIP≥1且p<0.05 阅读提示：Methods“Metabolite profiling of saker blood samples using UPLC-MS/MS”及Fig. 3f、3g |