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        基于环状RNA的蛋白替代疗法缓解雄性小鼠骨关节炎

        Circular RNA-based protein replacement therapy mitigates osteoarthritis in male mice.

        作者信息Jinlong Suo, Ling Li, Wuyuan Tan, Xubin Yin, Jinghui Wang, Rui Shao, Shaokun Sun, Si-Kun Guo, Jingyi Feng, Bao-Qing Gao, Ying Wang, Meng-Yuan Wei, Lijun Wang, Heng Feng, Xiang Gao, Ping Hu, Xianyou Zheng, Ling-Ling Chen, Guanghua Lei, Youkui Huang, Weiguo Zou
        PMID41006212
        期刊Nat Commun
        发布时间2025-09-26
        DOI10.1038/s41467-025-63343-z
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含体外软骨细胞、DMM小鼠模型、Msi2基因敲除与条件敲除小鼠、人OA软骨样本及AAV和ivcRNA两种递送验证

        主要模型

        DMM诱导的雄性C57BL/6小鼠骨关节炎模型 Msi2软骨细胞特异性条件敲除小鼠 人骨关节炎软骨组织样本 小鼠原代关节软骨细胞及软骨微团培养

        重点核对

        DMM模型中ivc-IRES4-Msi2-LNPs每周关节腔注射一次，8周后取材分析 ivcRNA注射剂量为100 ng或300 ng，低于mRNA治疗的5-50 μg AAV2/9-Msi2关节腔注射10 μL（1×10^10 vg） DMM手术在8-12周龄雄性C57BL/6小鼠进行 SM-102-LNPs脂质摩尔比SM-102:DSPC:胆固醇:DMG-PEG2000为50:10:38.5:1.5

        摘要

        体外转录并环化的RNA（ivcRNA）是一个稳健的持续蛋白翻译平台，为关节疾病的局部治疗递送提供了广阔前景。骨关节炎（OA）是最常见的退行性关节疾病，由于其进行性特征和缺乏改善病情的治疗手段，仍是重大临床挑战。在本研究中，我们确定关节软骨细胞中Musashi2（Msi2）的缺陷是OA发病的关键因素。为评估ivcRNA介导的蛋白替代疗法的疗效，我们开发了一种局部递送策略，能够在软骨细胞中实现高产且持久的蛋白表达。利用内侧半月板失稳（DMM）小鼠模型，我们证明关节腔内递送编码MSI2的ivcRNA可有效减轻雄性小鼠的OA进展。此外，通过ivcRNA递送治疗性补充MSI2下游效应分子SOX5进一步验证了该方法。我们的发现确立了基于ivcRNA的蛋白替代作为一种潜在的骨关节炎RNA治疗策略。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        关节软骨细胞中RNA结合蛋白MSI2的缺陷是否驱动骨关节炎，以及基于ivcRNA的蛋白替代疗法能否缓解OA进展。
        核心机制
        MSI2作为RNA结合蛋白结合Sox5 mRNA的3'UTR，促进SOX5蛋白翻译，进而调控软骨细胞代谢与分化；MSI2缺失导致软骨细胞代谢异常和细胞外基质降解。
        主要证据
        在DMM小鼠模型、Msi2基因敲除和软骨细胞特异性条件敲除小鼠中观察到OA加重；关节腔注射ivc-IRES4-Msi2-LNPs和ivc-IRES3-Sox5-LNPs可减轻DMM诱导的OA表型；RIP和报告基因实验证实MSI2结合并促进Sox5翻译。
        研究意义
        本研究将基于ivcRNA的蛋白替代确立为一种潜在的骨关节炎RNA治疗策略，并展示ivcRNA-LNPs可靶向关节软骨细胞实现低免疫原性和持久蛋白表达。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        筛选OA相关RNA结合蛋白

        鉴定骨关节炎中失调的关键RNA结合蛋白

        对DMM小鼠模型和老年诱导OA模型进行RNA-seq，筛选差异表达的RNA结合蛋白，并在人OA软骨中验证MSI2表达。

        2

        验证MSI2对软骨细胞代谢和OA进展的功能

        明确MSI2缺失是否影响软骨细胞代谢并加剧OA

        在Msi2敲低软骨细胞、Msi2全身敲除小鼠和软骨细胞特异性条件敲除小鼠中检测软骨代谢标志物，并在DMM手术后进行组织学分析。

        3

        AAV介导MSI2过表达的治疗验证

        验证补充MSI2能否缓解DMM诱导的OA

        DMM术后1周关节腔注射AAV-EGFP、AAV-Msi2或AAV-Msi2RBDmut，8周后通过micro-CT和SO&FG染色评估OA表型。

        4

        建立ivcRNA关节腔局部递送系统

        验证ivcRNA能否在关节腔内递送并在软骨细胞中实现持久蛋白表达

        基于Ana_PIE_27nt系统合成ivcRNA，用LNPs包封后关节腔注射，通过生物发光成像、RT-qPCR和免疫荧光检测fLuc、mCherry和EGFP表达。

        5

        ivcRNA-MSI2治疗OA的效果评估

        评估基于ivcRNA的MSI2蛋白替代疗法对DMM诱导OA的治疗效果

        筛选最佳翻译的ivc-IRES4-Msi2，用LNPs包封后每周关节腔注射DMM小鼠，8周后通过micro-CT、SO&FG染色和免疫组化评估OA表型及MSI2表达。

        6

        验证MSI2-SOX5翻译调控机制

        明确MSI2是否通过结合Sox5 3'UTR促进SOX5翻译

        通过RIP实验检测MSI2与Sox5 3'UTR的结合，用3'UTR报告基因和ActD实验验证翻译水平调控，并在Msi2缺陷软骨中检测SOX5和HMGB2表达。

        7

        ivcRNA-SOX5治疗OA的效果评估

        验证补充MSI2下游效应分子SOX5能否缓解OA

        筛选最佳翻译的ivc-IRES3-Sox5，用LNPs包封后每周关节腔注射DMM小鼠，7周后通过micro-CT、SO&FG染色和免疫组化评估OA表型及SOX5表达。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        RNA测序单细胞RNA测序分析微型CT分析番红O/固绿染色
        验证细胞功能变化
        阿利新蓝染色微团培养免疫荧光染色
        验证分子表达变化
        蛋白质印迹逆转录定量PCR免疫组织化学
        验证机制链路
        RNA免疫沉淀荧光素酶报告基因实验放线菌素D实验
        评估体内效果
        活体生物发光成像关节腔注射
        数据分析与统计
        OARSI组织病理学评分单因素方差分析双尾非配对t检验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        ivcRNA合成RiboMAX大规模RNA生产系统-T7PromegaP1300
        ivcRNA纯化Hipure RNA纯化微量试剂盒MagenR2144-03
        ivcRNA浓缩Amicon超滤管MiliporeUFC810024
        LNP制备NanoGenerator Flex-M微流控混合系统PreciGenome--
        SM-102可电离脂质MCE--
        胆固醇Sigma--
        DMG-PEG2000----
        活体生物发光成像D-荧光素PerkinElmer122799
        IVIS Spectrum CT活体成像系统PerkinElmer--
        关节腔注射5 μL微量注射器Hamilton7634-01
        Micro-CT分析SkyScan1176微型CT系统Bruker Biospin--
        免疫荧光染色驴抗兔Alexa Fluor 488/561二抗Molecular Probes--
        DAPISigmaD8417
        抗荧光淬灭封片剂DakoS3023
        Western blot抗Flag抗体SigmaF-3165
        Western blot/免疫组化抗MSI2抗体Abcamab76148
        抗SOX5抗体Abcamab94396
        抗HMGB2抗体Abcamab124670
        免疫组化抗MMP13抗体Proteintech18165-1-AP
        抗聚集蛋白聚糖抗体Proteintech13880-1-AP
        抗ADAMTS5抗体InvitrogenPA5-14350
        抗mCherry抗体SICGENAB8181-200
        抗GFP抗体Proteintech66002-1
        Western blot抗VINCULIN抗体MerkV4505
        抗ACTIN抗体SigmaA3854
        软骨分化培养TGFβ3Peprotech100-36E
        地塞米松SigmaD1756
        L-抗坏血酸2-磷酸SigmaA8960
        脯氨酸SigmaP5607
        胰岛素-转铁蛋白-硒CyagenITSS-10201-10
        阿利新蓝染色阿利新蓝SigmaA5268
        质粒提取SPARKeasy Superpure Midi质粒提取试剂盒Shandong Sparkjade Biotechnology Co., Ltd.--
        模板线性化XbaI限制性内切酶NEBR0145L
        poly(A)加尾大肠杆菌Poly(A)聚合酶TinzymeGMP-M012

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        DMM模型构建
        小鼠周龄和性别（8-12周龄雄性C57BL/6）、手术方式（内侧半月板韧带切断）、术后分析时间点（8周）
        阅读提示：Methods中DMM model小节及Fig. 1d、3e、4i图注
        ivcRNA-LNPs制备
        脂质摩尔比（SM-102:DSPC:胆固醇:DMG-PEG2000为50:10:38.5:1.5）、N/P比6:1、流速4 mL/min、缓冲液pH 4.5
        阅读提示：Methods中Lipid nanoparticle Formulation小节
        ivcRNA关节腔注射
        注射剂量（100 ng或300 ng）、注射频率（每周一次）、注射体积（5 μL）
        阅读提示：Fig. 3e、Supplementary Fig. 7g及Results中对应描述
        AAV关节腔注射
        AAV血清型（AAV2/9）、剂量（10 μL，1×10^10 vg）、注射时间（DMM术后1周）
        阅读提示：Methods中AAV injection小节及Fig. 1j图注
        Msi2条件敲除诱导
        他莫昔芬诱导起始时间（2周龄）、诱导天数（5天）、基因型（Col2-CreERT2; Msi2fl/fl）
        阅读提示：Methods中Mouse lines小节

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