CRISPR/Cas9全基因组筛选鉴定铁死亡相关基因
筛选调节铁死亡敏感性的肿瘤抑制因子
在PC9细胞中转导全基因组sgRNA文库，用RSL3处理48小时，测序分析sgRNA丰度变化
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
靶向ALDH16A1介导的硫氧还蛋白溶酶体降解以增强SMARCA4缺陷型非小细胞肺癌对铁死亡的敏感性
Targeting ALDH16A1 mediated thioredoxin lysosomal degradation to enhance ferroptosis susceptibility in SMARCA4-deficient NSCLC.
实验完整度
高包含CRISPR/Cas9全基因组筛选、多组学分析、细胞系、类器官、动物移植瘤及患者样本等多层级验证。
主要模型
人NSCLC细胞系PC9、H1975、HCC827（SMARCA4野生型） 人NSCLC细胞系A549、H23（SMARCA4缺陷型） 患者来源类器官（PDO） A549和LLC小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
RSL3处理浓度和时间：PC9 200 nM 6 h；A549 1000 nM 6 h；IKE浓度：PC9 2 μM 24 h，A549 40 μM 24 h 铁死亡抑制剂DFO（100 μM）、Fer-1（10 μM）及凋亡/坏死抑制剂的使用 ALDH16A1敲除或回补对RSL3/IKE诱导的铁死亡和脂质过氧化的影响 TXN抑制剂auranofin（1 μM预处理6 h）对铁死亡敏感性的影响 动物实验给药方案：IKE 30 mg/kg、auranofin 2 mg/kg、抗PD-1 100 μg/只，每两天腹腔注射
摘要
铁死亡是一种铁依赖性的细胞死亡形式，在癌症治疗中具有前景。然而，铁死亡与致癌突变之间的复杂联系仍不清楚。本研究表明，SMARCA4——一个公认的抑癌因子，其缺陷与不良预后和治疗耐药相关——使非小细胞肺癌（NSCLC）细胞对铁死亡敏感。机制上，SMARCA4促进染色质可及性和ALDH16A1的表达。令人惊讶的是，ALDH16A1缺乏ALDH酶活性，但与抗铁死亡的氧化还原酶硫氧还蛋白（TXN）结合，促进其向溶酶体转位并随后降解。同时，ALDH16A1通过遮挡TXN的活性位点直接抑制其氧化还原酶功能。我们还表明，在SMARCA4缺陷型NSCLC中，恢复ALDH16A1水平或抑制TXN均以铁死亡依赖的方式显著增强化疗/免疫治疗的疗效。总之，我们的发现阐明了一个复杂的SMARCA4-ALDH16A1-TXN稳定性/功能双重调控轴，该轴控制铁死亡，并为克服SMARCA4缺陷型NSCLC对化疗或免疫治疗的耐药性提供了治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SMARCA4缺陷如何影响NSCLC细胞对铁死亡的敏感性，及其分子机制是什么？
- 核心机制
- SMARCA4促进ALDH16A1的染色质可及性和表达；ALDH16A1与TXN结合，促进其溶酶体降解并直接抑制其氧化还原酶功能，从而增强铁死亡。
- 主要证据
- CRISPR/Cas9全基因组筛选发现SMARCA4为促铁死亡基因；多组学（ATAC-Seq、CUT&Tag、RNA-Seq）鉴定ALDH16A1为SMARCA4直接靶点；Co-IP和PLA证实ALDH16A1与TXN相互作用；CHX和CQ实验证明ALDH16A1促进TXN溶酶体降解；细胞活力、脂质过氧化和移植瘤实验验证功能。
- 研究意义
- 揭示了SMARCA4-ALDH16A1-TXN轴调控铁死亡的机制，为SMARCA4缺陷型NSCLC克服化疗和免疫治疗耐药提供了潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证SMARCA4对铁死亡的调控作用
确定SMARCA4敲除或回补对铁死亡敏感性的影响
在SMARCA4野生型和缺陷型NSCLC细胞中进行CRISPR/Cas9敲除或回补，用RSL3/IKE处理，检测细胞活力、脂质过氧化和线粒体形态
鉴定SMARCA4下游靶基因ALDH16A1
确定SMARCA4调控铁死亡的下游靶点
整合ATAC-Seq、CUT&Tag和RNA-Seq数据，筛选SMARCA4结合且调控的基因，验证ALDH16A1表达
验证ALDH16A1在铁死亡中的作用
确定ALDH16A1是否介导SMARCA4的促铁死亡作用
敲除或过表达ALDH16A1，检测RSL3/IKE诱导的铁死亡和脂质过氧化，以及铁死亡抑制剂的影响
研究ALDH16A1与TXN的相互作用及功能调控
阐明ALDH16A1调控铁死亡的分子机制
通过Co-IP和PLA验证ALDH16A1与TXN结合，检测TXN蛋白稳定性、酶活性和溶酶体定位
体内验证SMARCA4/ALDH16A1/TXN轴对铁死亡和免疫治疗的影响
在动物模型中验证该轴对铁死亡和PD-1抗体疗效的调控
建立A549和LLC皮下移植瘤模型，给予IKE、auranofin、AAV-ALDH16A1和抗PD-1抗体，监测肿瘤生长和免疫细胞浸润
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | ScienCell | -- | |
| 药物处理 | RSL3 | TargetMol | T3646 |
| IKE | TargetMol | T5523 | |
| ML210 | TargetMol | T8375 | |
| FIN56 | TargetMol | T4066 | |
| ferrostatin-1 | TargetMol | T6500 | |
| 甲磺酸去铁胺 | TargetMol | T1637 | |
| Z-VAD(OMe)-FMK | TargetMol | T6013 | |
| necrosulfonamide | TargetMol | T7129 | |
| 氯喹 | TargetMol | T8689 | |
| MG132 | TargetMol | T2154 | |
| liproxstatin-1 | TargetMol | T2376 | |
| 金诺芬 | MedChemExpress | HY-B1123 | |
| PX-12 | MedChemExpress | HY-13734 | |
| Conoidin A | MedChemExpress | HY-116090 | |
| Western blot | SMARCA4抗体 | Abclonal | A2117 |
| SMARCA2抗体 | Abclonal | A23291 | |
| ALDH16A1抗体 | Santa Cruz | sc-398693 | |
| TXN抗体 | Abclonal | A7638 | |
| ACSL4抗体 | Absin | abs106075 | |
| FSP1抗体 | Abclonal | A22278 | |
| Flag抗体 | Cell Signalling Technology | #14793 | |
| HA抗体 | Cell Signalling Technology | #3724 | |
| GPX4抗体 | Abways | CY6959 | |
| SLC7A11抗体 | Affinity | DF12509 | |
| GAPDH抗体 | Beyotime | AF0006 | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Topscience | -- |
| 脂质过氧化检测 | BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher | -- |
| 类器官培养 | 人肺癌类器官培养基试剂盒 | D1 Medical Technology | -- |
| 基质胶 | YEASEN | -- | |
| 类器官活力检测 | CellTiter-Lumi发光法3D细胞活力检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | TIANGEN | -- |
| Hifair® II第一链cDNA合成试剂盒 | Yeasen Biotechnology | -- | |
| Hifair® III SYBR Green RT-qPCR试剂盒 | Yeasen Biotechnology | -- | |
| CUT&Tag | Hyperactive™原位ChIP文库构建试剂盒（用于Illumina） | Vazyme Biotech | TD901-TD902 |
| H3K27ac抗体 | Cell Signalling Technology | #8173 | |
| H3K4me1抗体 | Cell Signalling Technology | #5326 | |
| ALDH活性检测 | ALDH活性检测试剂盒（比色法） | Abcam | ab155893 |
| TXN活性检测 | 硫氧还蛋白荧光活性检测试剂盒 | Cayman Chemical | -- |
| 免疫组化 | 抗4-HNE抗体 | Abcam | ab46545 |
| 免疫组化试剂盒 | ZSGB-BIO | SP-9002 | |
| 邻位连接实验 | Duolink®原位邻位连接试剂盒 | Sigma | -- |
| 流式细胞术 | Zombie Aqua可固定活力试剂盒 | BioLegend | #423101 |
| FITC抗小鼠CD45 | BioLegend | #103107 | |
| APC抗小鼠CD4 | BioLegend | #100515 | |
| PE抗小鼠CD8a | BioLegend | #100707 | |
| Brilliant Violet 421抗小鼠IFN-γ | BioLegend | #505829 | |
| 动物实验 | AAV-ALDH16A1 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR/Cas9筛选 | sgRNA文库覆盖度（114,155 sgRNA/19,060基因）、RSL3浓度（0.1 μM）和处理时间（48小时）、MOI（0.8）、puromycin浓度（1.2 μg/mL） 阅读提示：Methods中CRISPR/Cas9 screening小节 |
| 细胞活力检测 | 细胞接种密度（5000-10000 cells/well）、RSL3浓度（PC9 200 nM；A549 1000 nM）、处理时间（6小时）、CCK8孵育时间（1小时） 阅读提示：Methods中Cell viability assay小节及Figure 1、3、4图注 |
| 脂质过氧化检测 | BODIPY-C11浓度（4 μM）、孵育时间（30分钟）、RSL3处理浓度和时间（PC9 200 nM，A549 1000 nM，3小时） 阅读提示：Methods中Measurement of lipid peroxidation by BODIPY-C11小节及Figure 1i、3c图注 |
| TXN降解实验 | CHX浓度（100 μg/mL）、处理时间（0、4、8小时）、CQ浓度（10 μM）、MG132浓度（文中未明确说明） 阅读提示：Methods中相关小节及Figure 4m、n图注 |
| 动物实验 | 细胞接种量（2×10^6）、IKE剂量（30 mg/kg）、auranofin剂量（2 mg/kg）、抗PD-1剂量（100 μg/只）、给药频率（每两天一次）、小鼠品系和性别（BALB/c nude和C57BL/6J，雄性） 阅读提示：Methods中Tumour xenograft experiment小节及Figure 6d、i图注 |