鉴定VP3宿主互作蛋白
寻找与轮状病毒VP3相互作用的宿主因子
构建表达LAP标签VP3的HEK293稳定细胞系，进行串联亲和纯化联合LC-MS/MS，鉴定高置信度互作蛋白，并通过免疫共沉淀验证VP3与PFDN亚基的相互作用。
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前折叠素复合体促进干扰素刺激基因表达并被轮状病毒VP3抑制
Prefoldin complex promotes interferon-stimulated gene expression and is inhibited by rotavirus VP3.
实验完整度
高多层级证据：过表达/敲除细胞模型、蛋白互作与直接结合实验、体内小鼠模型及类肠器官验证
主要模型
HEK293细胞（野生型及PFDN3/PFDN4/UBA3敲除） A549细胞 人肠道类肠器官（H549） 新生小鼠轮状病毒感染模型
重点核对
PFDN3或PFDN4敲除HEK293细胞中轮状病毒（UK株，MOI=5）NSP5 mRNA水平及病毒滴度在48和72 hpi升高 IFN-β（500 U/ml，24 h）刺激下PFDN敲除细胞中ISGs（IFITM1、MX1、OAS3等）mRNA和蛋白水平降低 VP3与PFDN3直接结合：His pull-down和BLI实验 VP3通过其GTase/RTPase结构域（氨基酸670-689，关键残基D671和Y677）竞争性结合PFDN，减少PFDN-UBA3相互作用 UBA3敲除细胞中IRF9 mRNA和蛋白水平降低，ISG表达受抑制
摘要
及时诱导干扰素和干扰素刺激基因（ISGs）对于宿主成功防御病毒感染至关重要。轮状病毒编码的VP3被认为参与干扰素拮抗，但精确机制尚不完全清楚。通过串联亲和纯化结合高分辨率质谱，我们发现前折叠素复合体是VP3最主要的细胞结合伴侣。轮状病毒感染在前折叠素亚基敲除细胞中显著增强。利用全蛋白质组无标记定量，我们发现前折叠素协助折叠泛素样修饰激活酶3（UBA3），两者均正向调控ISG表达。通过直接和竞争性结合，VP3干扰前折叠素的伴侣活性，导致UBA3不稳定，减少IRF9，并抑制ISG转录。我们的发现报道了前折叠素-UBA3-IRF9-ISG轴在抗病毒免疫中的新功能，并揭示了病毒-宿主相互作用的新方面，可用于广谱抗病毒治疗开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 前折叠素复合体是否具有抗病毒功能并调控宿主天然免疫，以及轮状病毒VP3如何拮抗该通路。
- 核心机制
- 前折叠素复合体作为伴侣蛋白稳定UBA3，UBA3通过IRF9促进ISG转录；轮状病毒VP3通过其GTase/RTPase结构域（氨基酸670-689）竞争性结合前折叠素，破坏前折叠素-UBA3相互作用，导致UBA3不稳定、IRF9减少和ISG转录抑制。
- 主要证据
- 在HEK293细胞中通过CRISPR/Cas9敲除PFDN3/PFDN4/UBA3，结合RNA-seq、RT-qPCR、western blot、免疫共沉淀、His pull-down和BLI实验，证明前折叠素-UBA3-IRF9轴调控ISG表达；利用反向遗传学拯救VP3突变病毒，在人肠道类肠器官和新生小鼠模型中验证VP3突变对ISG抑制和病毒复制的影响。
- 研究意义
- 报道了前折叠素-UBA3-IRF9-ISG轴在抗病毒免疫中的新功能，揭示了轮状病毒VP3通过竞争性结合前折叠素逃逸宿主免疫的新策略，为广谱抗病毒治疗开发提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证PFDN对轮状病毒复制的影响
明确PFDN在轮状病毒感染中的作用
利用CRISPR/Cas9构建PFDN3或PFDN4单克隆敲除HEK293细胞，感染轮状病毒UK株、WI61株和OSU株，检测病毒NSP5 mRNA水平和病毒滴度。
验证PFDN对ISG表达的调控
探究PFDN抑制轮状病毒的机制是否通过IFN/ISG通路
用IFN-β刺激WT和PFDN敲除细胞，进行RNA-seq转录组分析和RT-qPCR验证ISG表达；用poly(I:C)转染检测OAS-RNase L通路活化；检测轮状病毒感染诱导的ISG产生。
鉴定PFDN底物及其对ISG的调控
寻找介导PFDN调控ISG的关键底物
对WT、PFDN3 KO和PFDN4 KO细胞进行无标记定量蛋白质组学，鉴定在敲除细胞中丰度降低的蛋白；用特异性抑制剂验证候选蛋白；通过免疫共沉淀和His pull-down验证UBA3与PFDN的直接相互作用。
验证UBA3在ISG产生中的作用
明确UBA3对ISG表达的调控及其与PFDN的上下游关系
构建UBA3敲除和UBA3/PFDN4双敲除HEK293细胞，检测IFN-β诱导的MX1和OAS3表达；用ruxolitinib阻断IFN下游信号，检测轮状病毒复制；检测IRF9表达。
解析VP3竞争性抑制PFDN-UBA3相互作用的分子机制
确定VP3与PFDN结合的结构域及关键氨基酸
构建VP3系列截短突变体，通过免疫共沉淀定位PFDN结合区域；利用AlphaFold-3预测相互作用界面，构建缺失突变体和点突变体验证；合成VP3 670-689肽段进行BLI竞争实验；拯救表达Flag标签GTase/RTPase结构域的重组轮状病毒验证感染条件下的相互作用。
验证VP3关键氨基酸对ISG抑制和病毒复制的影响
在感染背景下验证D671和Y677对VP3拮抗ISG及病毒复制的作用
利用反向遗传学拯救携带VP3 WT或D671A/Y677A突变的 recombinant 轮状病毒，感染WT和PFDN敲除细胞，检测MX1表达；感染人肠道类肠器官，检测病毒复制和MX1表达；感染新生小鼠，检测肠道病毒复制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| Advanced DMEM培养基 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Medium 199培养基 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| G-418 | Promega | -- | |
| 病毒激活 | 胰蛋白酶 | Gibco Life Technologies | -- |
| 质粒构建 | Quikchange II定点突变试剂盒 | Agilent | -- |
| QIAGEN质粒大量制备试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| Western blot和免疫共沉淀 | 兔抗PFDN3抗体 | Bethyl Laboratories | A305-403A |
| 兔抗PFDN4抗体 | Proteintech | 16045-1-AP | |
| 鼠抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 鼠抗Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2276S | |
| 兔抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118S | |
| 鼠抗β肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970S | |
| 兔抗OAS3抗体 | Invitrogen | PA5-59539 | |
| 兔抗OAS1抗体 | Cell Signaling Technology | 14498S | |
| 兔抗ISG15抗体 | Proteintech | 15981-1-AP | |
| 兔抗IFITM1抗体 | Cell Signaling Technology | 131263 | |
| 兔抗MX1抗体 | Proteintech | 13750-1-AP | |
| 兔抗IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4302S | |
| 兔抗STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9172S | |
| 兔抗磷酸化STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9174S | |
| 兔抗STAT2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-514193 | |
| 鼠抗UBA3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-377272 | |
| 兔抗IRF9抗体 | Cell Signaling Technology | 76684 | |
| 辣根过氧化物酶标记抗小鼠抗体 | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| 辣根过氧化物酶标记抗兔抗体 | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 594标记山羊抗小鼠抗体 | Thermo Fisher Scientific | A-11005 |
| 4′,6′-二脒基-2-苯基吲哚 | Invitrogen | 00-4959-52 | |
| 细胞刺激 | 干扰素β | R&D Systems | 8499-IF/CF |
| 抑制剂处理 | AGI6780 | Selleck Chemicals | S7241 |
| 双硫仑 | Selleck Chemicals | S1680 | |
| MLN4924 | Sigma-Aldrich | 505477 | |
| 二甲基亚砜 | VWR | VWRVN182 | |
| 串联亲和纯化 | S蛋白琼脂糖 | Millipore | -- |
| 2×NuPAGE上样缓冲液 | Invitrogen | -- | |
| 银染试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 24612 | |
| 免疫共沉淀 | 用于Western blot和免疫沉淀的细胞裂解液 | Invitrogen | FNN0021 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693132001 | |
| ChromoTek GFP-Trap®磁珠琼脂糖 | Proteintech | -- | |
| 免疫荧光 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| His pull-down | His-PFDN3蛋白 | Abcam | ab139201 |
| UBA3蛋白 | Abcam | ab140421 | |
| cOmplete™ His标签纯化树脂 | Roche | 05893801001 | |
| RT-qPCR | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| 高容量cDNA逆转录试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 4368814 | |
| RNase抑制剂 | ThermoFisher Scientific | N8080119 | |
| 2×SYBR green预混液 | ThermoFisher Scientific | 4368708 | |
| 2×TaqMan Fast Advanced预混液 | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| RNase L介导的rRNA裂解实验 | PureLink RNA小量提取试剂盒 | ThermoFisher | -- |
| 焦点形成实验 | AEC底物试剂盒 | Vector Laboratories | -- |
| RNA-seq | TruSeq RNA单索引接头 | -- | -- |
| Oligo-dT磁珠（mRNA Direct试剂盒） | Life Technologies | -- | |
| SuperScript III逆转录酶 | Life Technologies | -- | |
| LFQ质谱 | C18离心柱 | -- | -- |
| Neo捕集柱 | -- | -- | |
| PepMapTM Neo C18分析柱 | -- | -- | |
| Vanquish Neo超高效液相色谱系统 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Orbitrap Eclipse三合一质谱仪 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| BLI | Octet-Red96仪器 | ForteBio | -- |
| Ni-NTA生物传感器 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| VP3宿主互作蛋白鉴定 | HEK293细胞表达LAP标签VP3（RRV株）的诱导条件、串联亲和纯化步骤、质谱鉴定参数 阅读提示：Methods 'Tandem affinity purification and mass spectrometry'及Supplementary Data 1 |
| PFDN敲除对轮状病毒复制的影响 | PFDN3/PFDN4敲除细胞系、轮状病毒株（UK、WI61、OSU）、MOI=5、感染时间点（24、48、72 hpi）、检测指标（NSP5 mRNA、病毒滴度） 阅读提示：Fig. 2c-f图注及Methods 'CRISPR/Cas9 knockout cells'和'Focus-forming assays' |
| IFN-β诱导ISG表达 | IFN-β浓度500 U/ml、刺激时间24 h、检测ISG种类（IFITM1、MX1、OAS3等）、RNA-seq和RT-qPCR条件 阅读提示：Fig. 3a-d图注及Methods 'RT-qPCR'和'RNA-seq' |
| UBA3在ISG产生中的作用 | UBA3敲除细胞（sgRNA1、sgRNA2）、UBA3/PFDN4双敲除细胞、IFN-β刺激条件、ruxolitinib浓度10 μM、轮状病毒感染MOI=5 阅读提示：Fig. 5b-e图注及Methods 'CRISPR/Cas9 knockout cells' |
| VP3竞争性结合PFDN的分子机制 | VP3截短突变体、AlphaFold-3预测、VP3 Δ670-689和D671A/Y677A突变体、肽段竞争实验浓度（50 μM）、BLI条件（30°C，PBS） 阅读提示：Fig. 6c-f图注及Methods 'Bio-layer interferometry (BLI) assays' |
| 体内验证VP3突变对病毒复制的影响 | 新生小鼠日龄（5天）、感染剂量（1.5×10^3 FFU）、感染途径（口服）、检测时间（24 hpi）、组织（肠道） 阅读提示：Methods 'In vivo experiments'及Supplementary Fig. 14e,f |