建立HCMV感染模型并进行Hi-C分析
确定HCMV感染对宿主基因组三维组织的影响
NHDF以MOI 5感染TB40/E，于72、96、120 h.p.i.收集，甲醛交联后进行Hi-C文库构建和测序，分析染色质接触、区室和TAD变化
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微管机械转导精细调控巨细胞病毒与宿主染色质的相互作用及重塑
Microtubule mechanotransduction refines cytomegalovirus interactions with and remodeling of host chromatin.
实验完整度
高包含Hi-C、TTseq/RNAseq、CUT&RUN多组学及RNAi功能验证，覆盖宿主与病毒基因组互作和机制
主要模型
原代人正常真皮成纤维细胞（NHDF） HCMV临床株TB40/E感染NHDF（MOI 5） siRNA敲低ATAT1或SUN1的NHDF
重点核对
NHDF感染HCMV TB40/E MOI 5，于72、96、120 h.p.i.收集 Hi-C使用Arima HiC+ Kit，约1-2百万细胞，2×150 bp测序 TTseq于收集前1小时以500 μM 4-硫尿苷脉冲60分钟 CUT&RUN使用H3K4me3和H3K9me3抗体，E.Coli DNA spike-in归一化 siRNA转染150 pmol/ml，感染后12小时处理，96/120小时时间点于72小时二次敲低
摘要
人巨细胞病毒广泛改变核组织和细胞转录组，然而对这些全基因组事件的理解仍相对有限。本文通过染色质构象捕获（Hi-C）揭示了巨细胞病毒如何在宏观和微观尺度上改变染色体组织。新生转录组学进一步揭示了转录变化如何与基因组重组相关，同时发现了感染诱导的转录失调，该失调促成了感染成纤维细胞中神经元基因特征的诱导。结合Hi-C与核酸酶靶向切割释放（CUT&RUN），我们发现病毒基因组优先定位于高度常染色质的区室，进一步失调宿主基因的转录。最后，通过RNAi介导的消耗两个作用于核的微管力关键效应因子，我们深入了解了它们在调控区室尺度接触及病毒基因组与宿主染色质相互作用中的不同角色。综上，我们揭示了HCMV与宿主染色质和转录相互作用及改变的程度，以及微管机械转导对这些过程的影响。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HCMV在全局尺度上如何影响宿主基因组组织和新生转录活性，以及微管机械力在这些过程中的作用是什么？
- 核心机制
- HCMV感染广泛重塑宿主染色质区室和TAD组织，病毒基因组优先定位于高度常染色质的A2/A3区室；微管机械转导通过乙酰化微管和SUN1介导的LINC复合物将宿主染色质（尤其是抑制性B区室）拉向装配区室，从而优化病毒与宿主基因组的空间分离，但对抗原转录重编程无显著直接影响。
- 主要证据
- Hi-C显示感染后长程染色体间接触减少、A-B区室接触增加、TAD绝缘减弱；TTseq/RNAseq鉴定数千差异表达基因及读入/读通事件；CUT&RUN H3K9me3证实病毒reads富集于A区室；ATAT1或SUN1敲低改变病毒-宿主接触模式但仅少数基因表达显著变化。
- 研究意义
- 揭示了HCMV与宿主染色质相互作用及改变的程度，并阐明微管机械转导在精细调控病毒-宿主基因组空间分离中的作用，为理解疱疹病毒核内复制与宿主基因组组织的关系提供了新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
新生转录组和总RNA测序
解析感染对新生转录和稳态转录组的影响及其与染色质重塑的相关性
在收集前1小时用4-硫尿苷标记新生RNA，分离生物素化新生RNA进行TTseq，同时保留总RNA进行RNAseq，比对并鉴定差异表达基因、读入和读通事件
CUT&RUN分析组蛋白修饰与病毒基因组定位
独立验证区室分类并确定病毒基因组与宿主染色质的相互作用区域
使用H3K4me3和H3K9me3抗体进行CUT&RUN，结合Hi-C数据定义病毒富集区域（VERs），分析病毒reads在区室中的分布
RNAi敲低ATAT1或SUN1并结合Hi-C和TTseq
探究微管机械转导在病毒-宿主基因组相互作用及宿主转录重编程中的作用
使用两种独立siRNA敲低ATAT1或SUN1，进行Hi-C和TTseq，比较病毒接触模式和基因表达变化
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证基因功能
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | Corning | 25-052-CI | |
| RNA干扰 | 对照非靶向siRNA-A | ThermoFisher Scientific | AM4635 |
| 对照非靶向siRNA-B | ThermoFisher Scientific | AM4637 | |
| αTAT1 siRNA-A | ThermoFisher Scientific | AM16708A, ID: 130789 | |
| αTAT1 siRNA-B | ThermoFisher Scientific | 4392420, ID: s36739 | |
| SUN1 siRNA-A | ThermoFisher Scientific | AM16708A, ID: 222696 | |
| SUN1 siRNA-B | ThermoFisher Scientific | AM16708A, ID: 241855 | |
| Lipofectamine siRNA max转染试剂 | Invitrogen | 13778075 | |
| Western blot | 乙酰化α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T6793 |
| SUN1抗体 | Novus Biologicals | NBP1-87396 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| 硝酸纤维素膜 | GE Healthcare Life Sciences | -- | |
| ECL检测底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Hi-C | Arima HiC+试剂盒 | Arima | A410231 |
| 甲醛 | Fisher | F79-500 | |
| NEB Ultra II DNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E7645S | |
| CUT&RUN | CUT&RUN试剂盒 | Epicypher | 14-1048 |
| H3K4me3抗体 | Cell Signaling Technology | 9751 | |
| H3K9me3抗体 | Cell Signaling Technology | 4658 | |
| TTseq | 4-硫尿苷 | Sigma-Aldrich | T4509 |
| TRIzol试剂 | Thermo Fisher | 15596018 | |
| Qubit 3.0荧光计 | Invitrogen | -- | |
| Qubit RNA BR检测试剂盒 | Invitrogen | Q10210 | |
| Qubit RNA完整性检测 | Invitrogen | Q33221 | |
| NEBNext RNA片段化缓冲液 | New England Biolabs | E6150 | |
| RNAClean XP磁珠 | Beckman Coulter | A63987 | |
| MTSEA-生物素-XX | Biotium | 90066 | |
| Dynabeads MyOne链霉亲和素C1磁珠 | Life Technologies | 65001 | |
| NEBNext rRNA去除试剂盒v2 | New England Biolabs | E7400 | |
| TTseq/RNAseq | NEBNext Ultra II定向RNA文库制备试剂盒（Illumina） | New England Biolabs | E7760 |
| RNAseq | NEBNext rRNA去除试剂盒v2 | New England Biolabs | E7400 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HCMV感染与Hi-C | 病毒株TB40/E、MOI 5、感染时间点72/96/120 h.p.i.、每个时间点2个生物学重复 阅读提示：Methods 'Cell culture and viruses'与'Hi-C Library preparation'；Fig. 1图注 |
| TTseq/RNAseq | 4-硫尿苷浓度500 μM、脉冲时间60分钟、72 h.p.i. n=2与96 h.p.i. n=4、siRNA处理条件 阅读提示：Methods 'TTseq Library preparation'与'RNAseq Library preparation'；Supplementary Fig. 4A-B |
| CUT&RUN | H3K4me3和H3K9me3抗体货号、96 h.p.i.、n=2、E.Coli DNA spike-in归一化 阅读提示：Methods 'CUT&RUN Library preparation'与'CUT&RUN Data processing'；Fig. 5C-D图注 |
| RNAi敲低 | siRNA浓度150 pmol/ml、转染试剂Lipofectamine siRNA max、感染后12小时首次敲低、72小时二次敲低 阅读提示：Methods 'RNA interference (RNAi) and Western Blotting'；Supplementary Fig. 11A |