hCitH3-mAb的构建与生产
获得高亲和力、低免疫原性的人源化抗CitH3单克隆抗体
从小鼠杂交瘤细胞中提取RNA并逆转录为cDNA，利用AI驱动的抗体工程进行人源化，去除HCDR2和LCDR1中的“NG”酰胺化基序，在CHO细胞中表达并筛选高表达克隆，经Protein A色谱纯化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
用于脓毒症免疫调节的瓜氨酸化组蛋白H3单克隆抗体
A citrullinated histone H3 monoclonal antibody for immune modulation in sepsis.
实验完整度
高包含体外巨噬细胞/中性粒细胞模型、小鼠脓毒症模型、基因敲除小鼠、人血清样本及多种功能与机制验证。
主要模型
THP-1细胞来源巨噬细胞 小鼠原代骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） 细菌感染及LPS诱导的C57BL/6J小鼠脓毒症模型 脓毒症患者血清样本
重点核对
铜绿假单胞菌（ATCC 19660）经鼻滴入剂量2.5×10^6 CFU，hCitH3-mAb（20 mg/kg）尾静脉注射 LPS腹腔注射剂量25 mg/kg，hCitH3-mAb（20 mg/kg）尾静脉注射 THP-1巨噬细胞经PMA（100 ng/mL）分化48小时，铜绿假单胞菌MOI=100刺激 BMDMs分别来源WT、Tlr2−/−、Pad2−/−和Pad2/4−/−小鼠，CitH3肽处理剂量15-50 μg/mL 生存分析每组n=6-8只，独立重复三次；Western blot等实验至少三次独立重复
摘要
在脓毒症早期，免疫细胞释放的瓜氨酸化组蛋白H3（CitH3）通过过度NETosis和焦亡驱动炎症的恶性循环，导致免疫功能障碍和组织损伤。为调控这一过程，我们开发了一种人源化CitH3单克隆抗体（hCitH3-mAb），对其具有高亲和力和特异性。在小鼠模型中，hCitH3-mAb可减少LPS和铜绿假单胞菌引起的细胞因子产生、死亡率和急性肺损伤（ALI），同时增强肺、脾和肝脏中的细菌吞噬作用。利用预平衡数字ELISA（PEdELISA），我们确定了hCitH3-mAb在脓毒症诱导的ALI中的最佳治疗窗口。同时，我们探索了CitH3驱动炎症的分子机制。我们发现，在巨噬细胞中，CitH3激活Toll样受体2（TLR2），触发Ca2+依赖的PAD2自身瓜氨酸化和核转位，通过有害的正反馈环路放大CitH3产生。hCitH3-mAb治疗有效破坏这一循环，并在脓毒症条件下恢复巨噬细胞功能。总之，这些发现既突出了hCitH3-mAb的治疗潜力，也为脓毒症中CitH3–PAD2轴提供了深入的机制见解，支持其进一步开发用于治疗免疫介导的疾病。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CitH3在脓毒症中如何驱动免疫失调，以及靶向CitH3的人源化单克隆抗体能否减轻脓毒症相关炎症和肺损伤？
- 核心机制
- CitH3通过TLR2激活巨噬细胞，引起Ca2+升高、PAD2自身瓜氨酸化及核转位，形成正反馈环路持续放大CitH3产生和炎症。
- 主要证据
- 在LPS和铜绿假单胞菌诱导的小鼠脓毒症模型中，hCitH3-mAb降低细胞因子、提高生存率、减少细菌载量和急性肺损伤；体外实验证明hCitH3-mAb以剂量依赖方式保护巨噬细胞、减少焦亡标志物和NETosis；TLR2缺陷及PAD2敲除巨噬细胞证实了通路依赖性。
- 研究意义
- 为脓毒症及其他免疫介导疾病提供了靶向CitH3的治疗候选抗体，并揭示了CitH3–PAD2轴作为潜在干预靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
hCitH3-mAb与商业抗体的结合特性比较
验证hCitH3-mAb对CitH3的敏感性和特异性优于商业抗体
通过间接ELISA、直接ELISA和免疫印迹比较hCitH3-mAb与商业CitH3-mAb-3Cit对CitH3肽及修饰H3肽的结合能力，并检测人脓毒症血清样本中的CitH3水平。
hCitH3-mAb在小鼠脓毒症模型中的疗效评价
评估hCitH3-mAb对细菌感染和LPS诱导脓毒症的保护作用
在铜绿假单胞菌经鼻感染和LPS腹腔注射的小鼠模型中，尾静脉注射hCitH3-mAb或对照IgG，监测生存率、细菌载量、BALF细胞因子、肺组织病理及安全性指标。
CitH3体外诱导巨噬细胞损伤及hCitH3-mAb的保护作用
验证CitH3对巨噬细胞的直接损伤及hCitH3-mAb的中和效应
用CitH3肽或铜绿假单胞菌刺激THP-1巨噬细胞和BMDMs，检测细胞活力、LDH释放、吞噬功能、焦亡标志物和细胞因子，并加入hCitH3-mAb评估保护效果。
CitH3-TLR2-PAD2信号通路机制解析
阐明CitH3激活巨噬细胞的受体及下游信号机制
利用荧光标记CitH3摄取实验、Tlr2−/− BMDMs、钙离子成像、亚细胞分离、免疫印迹和体外瓜氨酸化实验，检测TLR2依赖性、Ca2+内流、PAD2自身瓜氨酸化及核转位。
hCitH3-mAb对CitH3诱导的NETosis和细胞因子风暴的抑制
验证hCitH3-mAb能否阻断CitH3正反馈环路及NETosis
用CitH3肽刺激BMDMs和BMDNs，加入hCitH3-mAb，检测细胞因子、干扰素、dsDNA释放和NETs形成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 超低IgG胎牛血清 | Gibco | -- | |
| RNA提取 | Qiagen RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | GE Life Sciences第一链cDNA合成试剂盒 | GE Life Sciences | -- |
| 细胞培养 | 佛波酯 | Sigma | -- |
| BMDM分化 | 集落刺激因子 | Peprotech | AF-315-02 |
| 中性粒细胞分离 | Histopaque 1119 | -- | -- |
| Histopaque 1077 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488染料 | Thermo Fisher | 46403 |
| 内吞抑制 | 细胞松弛素D | Sigma | C8273 |
| Dynasore | Sigma | D7693 | |
| 免疫荧光 | PAD2抗体 | Proteintech | 12110-1-AP |
| PAD4抗体 | Proteintech | 17373-1-AP | |
| Rab5抗体 | CST | 3547 | |
| EEA1抗体 | CST | 3288 | |
| 髓过氧化物酶抗体 | Abcam | ab208670 | |
| 吞噬实验 | pHrodo红色大肠杆菌生物颗粒 | Thermo Fisher | P35360 |
| 钙离子成像 | Fluo-4-AM钙离子荧光探针 | -- | -- |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo | CK04 |
| 细胞死亡检测 | 细胞死亡检测酶联免疫吸附测定试剂盒 | Roche | 11544675001 |
| ADCC实验 | ADCC报告基因生物测定核心试剂盒 | Promega | ADG7941 |
| LDH释放实验 | 乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | 11644793001 |
| 中性红实验 | 中性红实验试剂盒 | Sigma | TOX4-1KT |
| NETosis检测 | Quant-iT PicoGreen双链DNA检测试剂盒 | Invitrogen | P7581 |
| 抗体标记 | 辣根过氧化物酶标记试剂盒 | Abcam | ab102890 |
| ELISA检测 | CitH3检测抗体 | Abcam | ab5103 |
| 体外瓜氨酸化实验 | 重组人组蛋白H3 | Cayman | 10263 |
| His标签重组人PAD2 | Cayman | 10785 | |
| MBP标签重组人PAD2 | Sigma-Aldrich | SAE0061 | |
| 重组人PAD4 | Sigma-Aldrich | SAE0086 | |
| 瓜氨酸化检测 | 瓜氨酸特异性生物素探针 | Cayman | 17450 |
| 瓜氨酸化蛋白捕获 | 链霉亲和素-琼脂糖珠 | Thermo Fisher | 20353 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Fisher | 89901 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher | 87785 | |
| 核质分离 | NE-PER核质提取试剂 | Thermo Fisher | 78835 |
| Western blot | 商业CitH3单克隆抗体 | Cayman | 17939 |
| PAD2抗体 | Proteintech | 12110-1 | |
| 组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9715S | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970S | |
| 瓜氨酸抗体 | Cayman | 30773 | |
| Caspase-1抗体 | Cell Signaling Technology | 24232 | |
| PAD4抗体 | Abcam | ab214810 | |
| His标签抗体 | Proteintech | 66005-1-Ig | |
| 切割型Caspase-1抗体 | Cell Signaling Technology | 89332 | |
| GSDMD抗体 | Cell Signaling Technology | 39754 | |
| 切割型GSDMD抗体 | Cell Signaling Technology | 34667 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 97166 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 铜绿假单胞菌诱导脓毒症模型 | 细菌菌株（ATCC 19660）、剂量（2.5×10^6 CFU）、给药途径（经鼻滴入30 μL）、hCitH3-mAb剂量（20 mg/kg）及给药时间（感染后30分钟内尾静脉注射） 阅读提示：Methods“Animal models of sepsis”及图3a图注 |
| LPS诱导内毒素血症模型 | LPS剂量（25 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、hCitH3-mAb剂量（20 mg/kg）及给药时间（30分钟后尾静脉注射） 阅读提示：Methods“Animal models of sepsis”及图5a图注 |
| 体外巨噬细胞刺激实验 | THP-1细胞PMA分化浓度（100 ng/mL）和时间（48小时）、铜绿假单胞菌MOI（100）、CitH3肽剂量（15-50 μg/mL）及处理时间 阅读提示：Methods“Cell culture”及图6、图8图注 |
| TLR2/PAD2基因敲除实验 | 小鼠品系（Tlr2−/−、Pad2−/−、Pad2/4−/−）、BMDMs来源及CitH3肽处理浓度（15 μg/mL）和时间（1小时） 阅读提示：Methods“Animal models of sepsis”及图7、图8图注 |
| 生存分析 | 每组小鼠数量（6-8只）、独立实验次数（三次）、监测时间（10天）及盲法记录 阅读提示：图3a和图5a图注 |
| PEdELISA检测 | 血清样本量（8 μL）、检测时间点（每3小时）、细胞因子种类（6种）及与ELISA的相关性验证 阅读提示：Methods“Chip preparation and pre-equilibrium digital ELISA (PEdELISA)”及图5c、补充图3 |