AKI模型建立与lncRNA转录组筛选
鉴定AKI中差异表达的lncRNA并确认RSDR
建立顺铂诱导AKI与缺血再灌注损伤两种小鼠模型，对肾组织高通量测序，交集差异lncRNA，RT-qPCR验证RSDR，检测组织特异性与亚细胞定位
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长链非编码RNA RSDR通过与hnRNPK互作调控DHODH介导的铁死亡保护小鼠急性肾损伤
The long non-coding RNA RSDR protects against acute kidney injury in mice by interacting with hnRNPK to regulate DHODH-mediated ferroptosis.
实验完整度
高包含体外细胞、三种AKI小鼠模型、基因敲入/敲除小鼠、AAV体内过表达及69例AKI患者临床样本，含功能与机制验证。
主要模型
TCMK-1小鼠肾小管上皮细胞 C57BL/6J雄性小鼠三种AKI模型（顺铂、IRI、CLP） RSDR基因敲入小鼠与hnRNPK近端小管特异性敲除小鼠 AKI患者尿液样本（69例AKI与84例非AKI对照）
重点核对
顺铂30 mg/kg单次腹腔注射诱导AKI；CLP盲肠结扎穿刺；IRI双侧肾蒂夹闭45 min 体外TCMK-1细胞以50 µg/ml LPS或20 µM顺铂处理6–48 h，缺氧（1% O2）24 h后复氧6或12 h RSDR过表达（KI小鼠、慢病毒过表达细胞）与敲低（sh-RSDR）分组对照 hnRNPK近端小管特异性敲除（Ggt1-Cre×hnRNPKfl/fl）及AAV9-RSDR、AAV9-DHODH肾脏皮质注射回补 尿RSDR诊断AKI的ROC分析：AUC 0.7452，敏感性72.46%，特异性72.62%
摘要
急性肾损伤（AKI）是一种严重的临床疾病，其潜在机制仍不清楚。本研究鉴定长链非编码RNA RSDR是AKI中肾脏保护的关键调控因子。RSDR与RNA结合蛋白hnRNPK互作，形成正反馈环路，增强铁死亡抑制基因DHODH的转录。机制上，RSDR促进hnRNPK的核滞留，并促进DHODH的表观遗传激活，从而限制肾小管上皮细胞的铁死亡。在体内，RSDR过表达可减轻雄性小鼠AKI期间的铁死亡并保护肾功能。临床上，AKI患者尿液中RSDR水平显著降低，机器学习分析提示其具有疾病检测的潜在用途。这些发现突出RSDR是铁死亡的核心调控因子，并为lncRNA介导的AKI肾小管保护提供了机制见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AKI中铁死亡的分子调控机制尚不明确，本研究探究lncRNA RSDR在AKI肾小管上皮细胞铁死亡中的作用及机制。
- 核心机制
- RSDR与hnRNPK的KH3结构域结合，限制hnRNPK核输出，二者协同促进DHODH启动子区H3K27ac和H3K4me3修饰，激活DHODH转录，维持线粒体氧化还原稳态并抑制铁死亡；hnRNPK同时稳定RSDR，形成正反馈环路。
- 主要证据
- 通过ChIRP-MS、RNA pull-down、RIP鉴定RSDR-hnRNPK互作；ChIRP-seq、CUT&RUN、ChIP-qPCR和荧光素酶报告基因证实RSDR/hnRNPK共调控DHODH转录；在KI小鼠、hnRNPK敲除小鼠及AAV回补实验中检测DHODH、GPX4、PTGS2及4-HNE、MDA、CoQ/CoQH2等铁死亡指标。
- 研究意义
- 作者提出RSDR–hnRNPK–DHODH轴连接线粒体脂质代谢、铁死亡信号与表观遗传调控，尿RSDR可能反映早期肾损伤，具有进一步探索的AKI诊断价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RSDR体内外功能验证
验证RSDR对肾小管上皮细胞损伤的保护作用
构建肾脏特异性RSDR敲入小鼠，在三种AKI模型中检测肾功能、组织损伤与TUNEL；体外建立RSDR过表达和敲低细胞，检测增殖与死亡
RSDR互作蛋白鉴定与结合域定位
鉴定RSDR结合的核蛋白及其结合区域
ChIRP-MS鉴定RSDR结合蛋白，RNA pull-down与RIP验证hnRNPK互作，截短片段定位RSDR与hnRNPK KH3结构域结合区域
hnRNPK与RSDR协同调控AKI的体内回补实验
验证hnRNPK在AKI中的作用及RSDR的回补效应
构建近端小管特异性hnRNPK敲除小鼠，AAV9-RSDR肾皮质注射过表达，在AKI模型中检测肾功能与损伤标志物，并验证hnRNPK对RSDR的稳定作用
RSDR/hnRNPK共调控DHODH转录的机制验证
确定RSDR与hnRNPK共同调控的下游靶基因及转录机制
RNA-seq、ChIRP-seq与hnRNPK CUT&RUN整合筛选候选靶基因，RT-qPCR、Western blot、免疫荧光验证DHODH，ChIP-qPCR、荧光素酶报告基因及组蛋白修饰抑制剂验证转录调控
DHODH抑制铁死亡的功能验证
验证DHODH通过抑制铁死亡保护肾功能
检测AKI中DHODH表达与定位，使用Fer-1、Lip-1、BQR及MitoQ/MitoQH2干预，构建DHODH过表达与敲低细胞及AAV9-DHODH体内过表达，检测铁死亡指标与肾功能
RSDR/hnRNPK–DHODH轴调控铁死亡的体内验证
在体内确认RSDR与hnRNPK通过DHODH调控铁死亡
在KI小鼠与hnRNPK敲除小鼠顺铂处理后检测DHODH、GPX4、PTGS2及脂质过氧化指标，AAV9-DHODH回补hnRNPK敲除小鼠，并分析BQR与mitoQ干预效应
临床尿液样本与机器学习诊断分析
评估尿RSDR对AKI的诊断价值
收集AKI与非AKI患者尿液，RT-qPCR检测RSDR，ROC分析及五种机器学习模型评估诊断性能
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| AKI模型诱导 | 顺铂 | sigma | 479306 |
| 动物实验 | MitoQ | -- | -- |
| Brequinar | -- | -- | |
| Fer-1 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 细胞处理 | 脂多糖 | -- | -- |
| MitoQ | MCE | HY-100116A | |
| MitoQH2 | MCE | HY-124410 | |
| 表观遗传抑制 | A-485 | Selleck | S8740 |
| MM-102 | Selleck | S7265 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen Life Technologies | -- | |
| 质粒构建 | pGPU6/GFP/Neo载体 | GenePharma | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen Life Technologies | -- |
| RT-qPCR | Takara试剂盒 | Takara Biotechnology | -- |
| SYBR Green预混液 | Yeasen | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Institute of Biotechnology | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| ECL检测系统 | Millipore | -- | |
| ChIP-qPCR | 抗hnRNPK抗体 | Proteintech | 11426-1-AP |
| 抗H3K4me3抗体 | CST | #9751 | |
| 抗H3K27ac抗体 | CST | #8173 | |
| 肾功能检测 | 血清肌酐检测试剂盒 | Changchun Huili Biotech Co., Ltd. | K066 |
| 血尿素氮检测试剂盒 | Changchun Huili Biotech Co., Ltd. | K072a | |
| 全自动生化分析仪 | Shenzhen Rayto Life Science Co., Ltd. | -- | |
| 流式分析 | Annexin V-FITC/PI双染试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| FlowJo软件 | BD Biosciences | -- | |
| 荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| pGL3-basic载体 | -- | -- | |
| 线粒体脂质过氧化检测 | MitoPeDPP | Dojindo | -- |
| 荧光显微镜 | Keyence | BZ-X800 | |
| 线粒体分离 | 线粒体分离试剂盒 | 101 Bio | P507L |
| RNA-seq | NEBNext Ultra RNA文库构建试剂盒 | NEB | -- |
| ChIRP-MS液相色谱-质谱 | EASY-nLC液相色谱 | Thermo Fisher | -- |
| Orbitrap HFX质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| CoQ/CoQH2分析 | Zorbax Eclipse C18色谱柱 | Agilent | -- |
| 三重四极杆质谱仪 | Agilent | -- | |
| 叔丁基对苯二酚 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | CY3标记二抗 | Thermo Scientific | -- |
| Alexa Fluor-488标记二抗 | Thermo Scientific | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 荧光显微镜 | Nikon | -- | |
| RNA-seq | NanoDrop分光光度计 | -- | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| Qubit荧光定量仪 | -- | -- | |
| 图像分析 | ImageJ软件 | -- | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AKI动物模型建立 | 小鼠品系与性别年龄（雄性C57BL/6J，22–25 g，6–8周）；顺铂30 mg/kg单次腹腔注射；IRI双侧肾蒂夹闭45 min；CLP盲肠结扎1 cm并单次穿刺；取材时间Cis/IR 48 h、CLP 24 h；每组n=4–12 阅读提示：Methods中Mouse与Induction of AKI and drug administration小节 |
| RSDR基因敲入与hnRNPK敲除小鼠 | KI经ROSA26位点共注射gRNA、供体载体与Cas9 mRNA；hnRNPKfl/fl（S-CKO-18253）与Ggt1-Cre（C001456）杂交；基因型经尾尖DNA PCR鉴定 阅读提示：Methods中Mouse小节及Supplementary Fig. S2、S4 |
| 体外AKI细胞模型 | TCMK-1细胞；50 µg/ml LPS或20 µM顺铂处理6–48 h；缺氧5% CO2、1% O2、94% N2培养24 h后复氧6或12 h；每组n=3–4生物学独立实验 阅读提示：Methods中Cell culture小节及各图注 |
| RSDR-hnRNPK互作验证 | ChIRP-MS交联1%甲醛20 min、超声片段化、四个生物样本（两个RSDR、两个LacZ对照）；RSDR截短片段P1–P4；hnRNPK KH1–KH3结构域突变体；RIP-qPCR n=3 阅读提示：Methods中ChIRP-MS、RNA Pull-down and RIP小节；Fig. 3 |
| DHODH转录调控验证 | 荧光素酶报告基因含DHODH TSS上游500 bp及61 bp结合峰（chr8:110334971–110335031）；A-485 5 µM、MM-102 50 µM；ChIP-qPCR检测hnRNPK、H3K27ac、H3K4me3；n=3 阅读提示：Methods中ChIP-qPCR and ChIRP-qPCR、Luciferase reporter assay小节；Fig. 5及Supplementary Fig. S6 |
| 铁死亡与体内回补实验 | Fer-1 5 mg/kg、BQR 30 mg/kg、MitoQ 5 mg/kg腹腔注射；AAV9-RSDR/AAV9-DHODH肾皮质五个位点注射，1个月后评估；检测4-HNE、MDA、铁离子、CoQ/CoQH2；每组n=4–8 阅读提示：Methods中Induction of AKI and drug administration、Viral injection小节；Fig. 6、7 |
| 临床尿液样本与机器学习分析 | AKI 69例、非AKI 84例；KDIGO分期；尿液3000 rpm离心10 min取沉渣；5折交叉验证；特征为BUN、SCR、RSDR、eGFR；ROC的AUC 0.7452 阅读提示：Methods中Human patients and sample collection、Machine learning小节；Fig. 8 |