重组蛋白表达与纯化
获得用于体外结构研究的CHCHD10和CHCHD2 N端片段及全长蛋白
在大肠杆菌中表达带6x-His-SUMO标签的重组蛋白，经Ni-NTA亲和纯化、SUMO蛋白酶切割、阳离子交换层析，最后冻干。
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淀粉样纤维结构将CHCHD10和CHCHD2与神经退行性变联系起来
Amyloid fibril structures link CHCHD10 and CHCHD2 to neurodegeneration.
实验完整度
高体外重组蛋白、患者成纤维细胞、小鼠模型及冷冻电镜结构解析，包含功能与机制验证。
主要模型
重组CHCHD10和CHCHD2 N端片段及全长蛋白 患者皮肤成纤维细胞（p.R15L CHCHD10突变） D10S55L敲入小鼠心脏组织
重点核对
重组蛋白聚集反应：浓度80 µM，37°C，1200 rpm（D10-NT）或192小时（D2-NT），ThT荧光监测 冷冻电镜结构解析分辨率：WT D10-NT多晶型2.31-2.70 Å，D2-NT 2.03 Å，突变体3.06-3.15 Å 患者成纤维细胞：p.R15L CHCHD10突变男性60岁，对照女性55岁，ThioS染色共定位 小鼠模型：D10S55L敲入小鼠心脏组织，年龄P340， sarcosyl不溶性组分免疫金标记
摘要
线粒体蛋白CHCHD10和CHCHD2在罕见的遗传性FTD、ALS和PD病例中发生突变，并在受这些疾病影响的组织中聚集。在此，我们证明这两种蛋白均形成淀粉样纤维，并报道了由其无序N端结构域形成的纤维的冷冻电镜结构。这些纤维的有序核心由两种蛋白之间高度保守的区域组成，并且一部分CHCHD10和CHCHD2纤维结构具有结构相似性，似乎与该区域的序列变异相容。相反，位于这些纤维有序核心内的疾病相关突变CHCHD10 p.S59L和CHCHD2 p.T61I不能被野生型结构所容纳，并促进不同的原纤维折叠和纤维结构。这些结果将CHCHD10和CHCHD2淀粉样纤维与神经退行性变联系起来，并进一步提示WT蛋白的纤维形成也可能参与疾病病因学。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CHCHD10和CHCHD2是否形成淀粉样纤维，其结构如何，以及疾病相关突变如何影响纤维结构？
- 核心机制
- CHCHD10和CHCHD2的N端低复杂度结构域形成淀粉样纤维，其有序核心由高度保守区域组成；疾病相关突变（p.S59L和p.T61I）位于核心内，不能容纳于野生型结构，促进不同的原纤维折叠和纤维结构。
- 主要证据
- 重组蛋白ThT荧光和TEM显示纤维形成；冷冻电镜解析了WT和突变体纤维结构；患者成纤维细胞ThioS染色显示淀粉样聚集；D10S55L小鼠心脏提取物免疫金标记显示纤维。
- 研究意义
- 将CHCHD10和CHCHD2淀粉样纤维与神经退行性变联系起来，提示纤维形成可能参与疾病病因学，WT蛋白的纤维形成也可能与疾病相关。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证N端结构域的无序性
确认CHCHD10和CHCHD2 N端片段在溶液中缺乏二级结构
对纯化的D10-NT（1-98）和D2-NT（1-113）进行圆二色谱（CD）和核磁共振（NMR）分析。
体外淀粉样纤维形成检测
检测D10-NT和D2-NT能否形成淀粉样纤维
在聚集缓冲液中振荡孵育重组蛋白，用ThT荧光和透射电镜（TEM）监测纤维形成。
患者细胞中淀粉样聚集检测
验证疾病突变患者细胞中是否存在淀粉样聚集
对p.R15L CHCHD10突变患者皮肤成纤维细胞进行ThioS染色和CHCHD10免疫染色，共聚焦显微镜观察共定位。
小鼠模型中淀粉样纤维检测
验证D10在体内是否形成淀粉样纤维
从D10S55L敲入小鼠心脏组织提取sarcosyl不溶性组分，进行过滤陷阱实验和免疫金标记TEM。
冷冻电镜结构解析
解析WT和突变体纤维的高分辨率结构
对体外组装的WT D10-NT、D2-NT、S59L D10-NT、T61I D2-NT和R15L D10-NT纤维进行冷冻电镜数据收集和螺旋重建。
突变对聚集动力学的影响
比较疾病突变对纤维形成速率的影响
用ThT荧光监测WT和突变体D10-NT及D2-NT的聚集 kinetics，计算T50值。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质表达与纯化 | In-Fusion克隆试剂盒 | Takara Bio | -- |
| 镍柱 | -- | -- | |
| HiTrap SP HP柱 | GE | -- | |
| PD-10脱盐柱 | Cytiva | -- | |
| 圆二色谱 | AVIV 410圆二色谱仪 | AVIV | -- |
| ThT荧光测定 | 硫黄素T | -- | -- |
| Eppendorf恒温混匀仪 | Eppendorf | -- | |
| 微孔板荧光读数仪 | Molecular Devices | -- | |
| 透射电子显微镜 | JEOL JEM 1400透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| 免疫荧光染色 | 抗CHCHD10一抗 | ProteinTech | 25671-1-AP |
| 硫黄素S | Sigma-Aldrich | T1892 | |
| 免疫金标记 | 兔抗CHCHD10抗体 | Abcam | Ab121196 |
| 冷冻电镜 | Quantifoil R1.2/1.3多孔铜网 | Quantifoil | -- |
| Vitrobot Mark IV冷冻制样机 | FEI, Thermo | -- | |
| 核磁共振 | Bruker AVANCE 500 MHz核磁共振谱仪 | Bruker | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外纤维组装 | 蛋白浓度、缓冲液组成、振荡速度、温度、时间 阅读提示：Methods: Thioflavin T aggregation reactions; Table 1 |
| 冷冻电镜数据收集 | 显微镜型号、放大倍数、像素大小、总剂量、分辨率 阅读提示：Methods: Cryo-EM sample preparation and data collection; Table 2 |
| 小鼠组织提取 | 小鼠基因型、年龄、组织类型、sarcosyl浓度 阅读提示：Methods: Extraction of sarcosyl-insoluble fractions; Fig. 3 |
| 患者成纤维细胞染色 | 患者突变类型、年龄、性别、抗体稀释比例、ThioS浓度 阅读提示：Methods: Fibroblast imaging; Fig. 2e |