计算筛选框架构建与验证
建立并验证结合MD模拟与主动学习的虚拟筛选流程，评估靶点特异性评分相对于对接评分的优势。
利用同源模型和MD模拟生成20个受体结构集合，对DrugBank库化合物进行对接和评分；在DrugBank库上模拟主动学习筛选，比较不同评分和受体集合配置的效率。
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模拟与主动学习实现高效鉴定经实验验证的广谱冠状病毒抑制剂
Simulations and active learning enable efficient identification of an experimentally-validated broad coronavirus inhibitor.
实验完整度
高含计算筛选（MD模拟、主动学习）、生化酶活实验、活病毒及假病毒细胞进入实验多层级验证
主要模型
TMPRSS2生化酶活 assay Calu-3人肺细胞系 SARS-CoV-2活病毒及假病毒 Vero E6-TMPRSS2细胞
重点核对
BMS-262084在TMPRSS2生化 assay中的IC50 = 1.82 nM（三次技术重复） 活SARS-CoV-2感染Calu-3细胞：BMS-262084 IC50为0.51 µM（荧光显微镜）及8.66 nM（AY.1）、8.03 nM（KP.3.1.1）（空斑实验） 假病毒进入Calu-3细胞：BMS-262084对多种SARS-CoV-2变异株及HCoV-NL63、HCoV-229E、SARS-CoV-1、MERS-CoV的IC50 抑制剂预孵育时间（1、4、8、18、48 h）对IC50的影响 MD模拟：受体集合20个结构（10 apo、4 nafamostat-bound、6 camostat-bound）及40×1 µs BMS-262084复合物模拟用于马尔可夫状态建模
摘要
药物筛选如同大海捞针：从大量潜在药物中鉴定出少数有效抑制剂。大规模实验筛选昂贵且耗时，而虚拟筛选需要在计算效率与实验相关性之间权衡。本文开发了一个结合分子动力学（MD）模拟与主动学习的框架。两个组分将需要实验测试的候选物数量大幅减少至20个以下：（1）评估靶点抑制的靶点特异性评分；（2）生成受体构象集合的大量MD模拟。主动学习方法将需要实验测试的化合物数量减少到10个以下，并将计算成本降低约29倍。利用该框架，我们发现了BMS-262084作为TMPRSS2的有效抑制剂（IC50 = 1.82 nM）。细胞实验证实了BMS-262084阻断多种SARS-CoV-2变异株和其他冠状病毒进入的功效。所鉴定的抑制剂有望用于治疗涉及TMPRSS2的病毒性和其他疾病。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用靶点特异性评分、蛋白质灵活性和主动学习，从大规模化合物库中高效鉴定TMPRSS2抑制剂？
- 核心机制
- BMS-262084的胍基丁烷基团与TMPRSS2 S1口袋底部的Asp435形成盐桥，其β-内酰胺环与催化Ser441接近，可能通过酰化和水解两步反应机制抑制TMPRSS2。
- 主要证据
- 主动学习框架从DrugBank中筛选出BMS-262084，生化实验测定其IC50为1.82 nM；活病毒和假病毒实验证明其抑制多种SARS-CoV-2变异株及其他冠状病毒进入Calu-3细胞。
- 研究意义
- 该框架为丝氨酸蛋白酶靶点的抑制剂发现提供了高效策略，BMS-262084有望作为抗病毒治疗药物进一步研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
靶点特异性评分与学习评分评估
评估h-score对TMPRSS2抑制剂的分类能力，以及学习版评分对胰蛋白酶结构域蛋白的泛化能力。
使用NCATS OpenData Portal数据集计算静态和动态h-score的敏感性；利用PDBbind数据集训练随机森林模型预测胰蛋白酶结构域蛋白的结合亲和力。
MD模拟对候选物排序和对接的影响
评估受体集合和MD评分对已知抑制剂排名的影响。
比较有无受体集合、静态与动态h-score等不同流程配置下，已知抑制剂在DrugBank库中的排名和计算成本。
主动学习加速化合物搜索
验证主动学习循环减少计算负担的效果。
模拟随机选择与主动学习选择的虚拟筛选，比较需要计算筛选的化合物数量和已知抑制剂排名。
鉴定BMS-262084并验证其生化抑制活性
从DrugBank筛选中鉴定候选抑制剂，并在生化实验中测定其IC50。
对DrugBank筛选排名最高的DB03417（对应BMS-262084）进行TMPRSS2生化酶活实验，测定IC50并与camostat和nafamostat比较。
预孵育时间对抑制剂效力的影响
探究不同预孵育时间下抑制剂IC50的变化。
在不同预孵育时间（1、4、8、18、48 h）下重复TMPRSS2生化实验，测定BMS-262084、camostat和nafamostat的IC50。
BMS-262084抑制活SARS-CoV-2进入Calu-3细胞
验证BMS-262084在细胞水平抑制活病毒进入的效果。
用BMS-262084预处理Calu-3细胞，感染活SARS-CoV-2（分离株hCoV-19/Germany/FI1103201/2020，MOI=1），24 h后通过荧光显微镜检测病毒核蛋白信号；另用空斑实验比较BMS-262084与camostat对Delta（AY.1）和Omicron（KP.3.1.1）变异株的抑制效果。
BMS-262084抑制假病毒进入Calu-3细胞
验证BMS-262084对多种冠状病毒S蛋白介导的细胞进入的抑制谱。
用BMS-262084或camostat预处理Calu-3细胞，加入携带不同冠状病毒S蛋白的假病毒，检测荧光素酶活性计算抑制率。
BMS-262084作用机制的结构分析
通过MD模拟和马尔可夫状态建模分析BMS-262084与TMPRSS2的结合模式和可能的作用机制。
对BMS-262084与TMPRSS2复合物进行40个1 µs的MD模拟，利用PyEMMA进行马尔可夫状态建模，识别亚稳态结合构象。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| TMPRSS2生化酶活实验 | Boc-Gln-Ala-Arg-AMC荧光底物 | Bachem | I-1550 |
| 重组人TMPRSS2蛋白 | Cusabio | CSB-YP023924HU | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 活SARS-CoV-2感染检测 | SARS-CoV-2核蛋白特异性抗体 | Sino Biologicals | 40143-R019 |
| Alexa-488标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | A-21467 | |
| 空斑实验 | 甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | M0512 |
| 化合物分配 | ECHO 655声波分配仪 | LabCyte | -- |
| 试剂分液 | BioRAPTR分液器 | Beckman Coulter | -- |
| 荧光检测 | PHERAstar酶标仪 | -- | -- |
| 空斑计数 | ZEISS Axio Vert.A1光学显微镜 | ZEISS | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TMPRSS2生化酶活实验 | TMPRSS2浓度（0.018 mg/ml）、底物浓度（10 µM）、缓冲液组成（50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 0.01% Tween20）、孵育时间（1 h）、检测波长（激发340 nm/发射440 nm） 阅读提示：Methods中'TMPRSS2 biochemical assay'小节 |
| 活SARS-CoV-2感染Calu-3细胞 | 病毒分离株（hCoV-19/Germany/FI1103201/2020）、MOI（1）、感染后检测时间（24 h）、BMS-262084浓度范围、空斑实验感染后48 h收集上清 阅读提示：Methods中'Inhibition of live SARS-CoV-2 cell entry'小节及Fig. 4c, d图注 |
| 假病毒进入实验 | 假病毒S蛋白类型、抑制剂浓度范围（25,000–0.25 nM，10倍系列稀释）、预孵育时间（1 h, 37°C）、检测时间（感染后16–18 h）、荧光素酶检测 阅读提示：Methods中'Inhibition of pseudovirus cell entry'小节及Fig. 4e–l图注 |
| MD模拟与主动学习 | 受体集合结构数量及来源、MD模拟时长（10 ns/配体，总计818 µs）、主动学习初始集比例（1%）、扩展集大小、SVR模型参数、CDDD编码 阅读提示：Methods中'Molecular dynamics simulations'和'Active learning cycle'小节，以及Table 1 |
| BMS-262084作用机制MD模拟 | 模拟数量（40个）、每个模拟时长（1 µs）、马尔可夫状态建模参数（VAMP降维、k-means 180中心、4状态HMM、滞后1 ns） 阅读提示：Methods中'Markov state modeling'小节及Supplementary Fig. S9 |