PFKM 磷酸化组蛋白 H3 并通过感知柠檬酸水平促进有丝分裂进程

PFKM phosphorylates histone H3 and promotes mitotic progression by sensing the levels of citrate.

作者信息Pianpian Lin, Yijun Qi, Huiying Chu, Hongyu Wu, Yajuan Zhang, Xiaolan Huang, Chen Li, Xiaoyan Xu, Hong Gao, Rong Zeng, Guohui Li, Weiwei Yang

PMID40695785

期刊Nat Commun

发布时间2025-07-22

DOI10.1038/s41467-025-62111-3

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实验完整度

高

包含体外细胞、PBMC、小鼠移植瘤模型及结构模拟，并进行功能与机制验证

主要模型

HeLa 宫颈癌细胞 U87 胶质瘤细胞和 RKO 结直肠癌细胞人外周血单个核细胞（PBMC）及 CD8+ T 细胞 U87/EGFRvIII 小鼠颅内移植瘤模型

重点核对

PFKM 敲除（gRNA）后 rescue 野生型或 K617A、L79A 突变体 PFKM 与柠檬酸结合关键位点 K617 及与核小体结合关键位点 K66、L79 的突变验证体外激酶实验中使用重组 PFKM 与重组组蛋白 H3 或核小体，检测 H3S10 磷酸化组蛋白 H3S10 磷酸化水平（Western blot）及有丝分裂指数、有丝分裂时长（活细胞时间序列成像）小鼠颅内或皮下移植瘤模型中肿瘤生长检测（生物发光成像、H&E 染色、肿瘤体积/重量）

摘要

新兴证据表明，代谢信号——包括营养物质可用性、生物合成中间产物和能量平衡——与细胞周期进程相关。然而，这些信号如何被细胞周期机制感知仍不清楚。柠檬酸是三羧酸循环的关键中间产物，其水平在有丝分裂（M 期）达到峰值，并被糖酵解酶 ATP 依赖性 6-磷酸果糖激酶 1 肌肉同工型（PFKM）检测，从而加速有丝分裂进程。机制上，柠檬酸结合 PFKM，破坏其四聚体结构使其转变为二聚体。二聚体 PFKM 与核小体相互作用，并作为蛋白激酶在组蛋白 H3 第 10 位丝氨酸（H3S10）上磷酸化组蛋白 H3，从而促进有丝分裂和细胞增殖。结构模拟揭示，当 H3S10 与 PFKM 催化位点对齐时，PFKM 与核小体的结合最佳。破坏柠檬酸-PFKM 或 PFKM-H3 相互作用会降低 H3S10 磷酸化，延迟有丝分裂，并抑制肿瘤生长和 T 细胞增殖。我们的发现表明，PFKM 作为柠檬酸传感器，将代谢信号与细胞周期调控耦合。

检测细胞周期各阶段柠檬酸水平

探究柠檬酸水平是否与细胞周期阶段相关

HeLa 细胞同步化至 M 期后释放至 G1、S 或 G2 期，LC-MS 检测各阶段柠檬酸丰度

外源柠檬酸处理及 CS 敲低对细胞有丝分裂的影响

验证柠檬酸水平变化对细胞有丝分裂进程的影响

HeLa/H2B-EGFP 细胞同步化后给予递增剂量外源柠檬酸处理或 siRNA 敲低 CS，计算有丝分裂指数并测量有丝分裂时长

鉴定柠檬酸结合蛋白及结合位点

寻找感知柠檬酸的蛋白并确定其结合位点

LiP-SMap 实验分析 HeLa 细胞裂解液中柠檬酸结合蛋白，分子对接和分子动力学模拟分析结合位点，MST 检测结合亲和力

验证 PFKM 与柠檬酸结合对细胞增殖的影响

验证 PFKM 感知柠檬酸调控有丝分裂和细胞增殖

PFKM 敲除 HeLa/H2B-EGFP 细胞回补 rPFKM WT 或 K617A，检测有丝分裂时长和集落形成能力

验证 PFKM 与组蛋白 H3 及核小体的相互作用

研究 PFKM 如何调控有丝分裂

PFKM 敲除后检测 H3S10 磷酸化；Co-IP、pulldown 实验验证 PFKM 与组蛋白 H3 及核小体相互作用；分子动力学模拟分析结合位点；突变体回补验证关键残基

验证 PFKM 作为蛋白激酶磷酸化 H3S10

明确 PFKM 是否直接磷酸化组蛋白 H3 S10 位点

体外激酶实验用重组 PFKM 与重组组蛋白 H3 或核小体孵育，检测 H3S10 磷酸化；催化活性突变体 D166A 验证

验证柠檬酸调控 PFKM 二聚化及 H3S10 磷酸化

探究柠檬酸如何增强 PFKM 介导的 H3S10 磷酸化

凝胶过滤色谱分析柠檬酸对 PFKM 四聚体的解聚作用；二聚化突变体 F639L 验证；细胞实验检测柠檬酸对 PFKM-H3 相互作用及 H3S10 磷酸化的影响

验证柠檬酸调控的 H3S10 磷酸化对肿瘤发生的作用

在体内和体外验证该通路对肿瘤细胞增殖和肿瘤生长的影响

U87 和 RKO 细胞中回补 PFKM WT、K617A 或 L79A，检测 H3S10 磷酸化、集落形成和软琼脂克隆形成；颅内或皮下移植瘤模型检测肿瘤生长

验证柠檬酸调控的 H3S10 磷酸化对 T 细胞增殖的影响

探究该通路对正常细胞（T 细胞）增殖的作用

人 PBMC 经 CD3/CD28 激活，柠檬酸处理或 PFKM 敲除后回补突变体，检测 CD8+ T 细胞有丝分裂指数和增殖；CD19 CAR-T 细胞中检测柠檬酸对增殖和杀伤能力的影响

实验环节	名称	品牌	货号
抗体	抗 PFKM 抗体	Proteintech	55028-1-AP
抗 Aurora B 抗体	Proteintech	39262
抗磷酸化 Aurora B (Thr232) 抗体	Origene	TA325250
抗组蛋白 H3 抗体	Abcam	ab1791
抗磷酸化组蛋白 H3 (Ser10) 抗体	Cell Signaling Technology	9701
抗 HA 抗体	Cell Signaling Technology	3724
抗组蛋白 H2B 抗体	Cell Signaling Technology	12364S
抗 Flag 抗体	Proteintech	20543-1-AP
抗肌动蛋白抗体	Proteintech	60008-1-lg
抗组蛋白 H2A 抗体	Abclonal	A3692
抗微管蛋白抗体	Sigma	T9026
抗组蛋白 H4 抗体	Sigma	05-858
流式细胞术	FITC 抗人 CD8 抗体	BioLegend	980908
Alexa Fluor 700 抗人 CD8 抗体	BioLegend	344724
细胞培养	嘌呤霉素	EMD Biosciences	540411-100MGCN
潮霉素	EMD Biosciences	400053
杀稻瘟菌素 S	Yeasen	60218ES10
激酶实验	ATP	InvivoGen	tlrl-atp
[γ−32P] ATP	PerkinElmer	NEG502A
药物处理	柠檬酸	SHANGHAI EXPERIMENT REAGENT	6132-04-3
酶活实验	6-磷酸果糖	Sigma	F3627
免疫沉淀	抗 Flag M2 亲和凝胶	Sigma	A2220
激酶实验	重组组蛋白 H3	New England Biolabs	M2507
细胞培养	多聚赖氨酸	Invitrogen	A3890401
免疫沉淀	抗 HA 琼脂糖	AOGMA	AGM90054
蛋白纯化	镍-NTA 树脂	GeneScript	L00223I-50
谷胱甘肽树脂	GeneScript	L00206
免疫沉淀	Dynabeads 蛋白 G 磁珠	Invitrogen	10003D
Dynabeads 链霉亲和素试用试剂盒	Invitrogen	65801D
T 细胞激活	ImmunoCult 人 CD3/CD28 T 细胞激活剂	STEMCELL	10971
T 细胞增殖	CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒	Invitrogen	65-0850-84

实验环节

名称

品牌

货号

抗体

抗 PFKM 抗体

Proteintech

55028-1-AP

抗 Aurora B 抗体

Proteintech

39262

抗磷酸化 Aurora B (Thr232) 抗体

Origene

TA325250

抗组蛋白 H3 抗体

Abcam

ab1791

抗磷酸化组蛋白 H3 (Ser10) 抗体

Cell Signaling Technology

9701

抗 HA 抗体

Cell Signaling Technology

3724

抗组蛋白 H2B 抗体

Cell Signaling Technology

12364S

抗 Flag 抗体

Proteintech

20543-1-AP

抗肌动蛋白抗体

Proteintech

60008-1-lg

抗组蛋白 H2A 抗体

Abclonal

A3692

抗微管蛋白抗体

Sigma

T9026

抗组蛋白 H4 抗体

Sigma

05-858

流式细胞术

FITC 抗人 CD8 抗体

BioLegend

980908

Alexa Fluor 700 抗人 CD8 抗体

BioLegend

344724

细胞培养

嘌呤霉素

EMD Biosciences

540411-100MGCN

潮霉素

EMD Biosciences

400053

杀稻瘟菌素 S

Yeasen

60218ES10

激酶实验

ATP

InvivoGen

tlrl-atp

[γ−32P] ATP

PerkinElmer

NEG502A

药物处理

柠檬酸

SHANGHAI EXPERIMENT REAGENT

6132-04-3

酶活实验

6-磷酸果糖

Sigma

F3627

免疫沉淀

抗 Flag M2 亲和凝胶

Sigma

A2220

激酶实验

重组组蛋白 H3

New England Biolabs

M2507

细胞培养

多聚赖氨酸

Invitrogen

A3890401

免疫沉淀

抗 HA 琼脂糖

AOGMA

AGM90054

蛋白纯化

镍-NTA 树脂

GeneScript

L00223I-50

谷胱甘肽树脂

GeneScript

L00206

免疫沉淀

Dynabeads 蛋白 G 磁珠

Invitrogen

10003D

Dynabeads 链霉亲和素试用试剂盒

Invitrogen

65801D

T 细胞激活

ImmunoCult 人 CD3/CD28 T 细胞激活剂

STEMCELL

10971

T 细胞增殖

CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒

Invitrogen

65-0850-84

环节	核对要点
有丝分裂指数和时长检测	细胞同步化方法（胸苷双阻断：2 mM 胸苷处理 18 h，释放 9 h，再处理 18 h，释放 9.5 h）；外源柠檬酸剂量（0、0.5、2.5、5 mM）；有丝分裂指数计算时间点（释放后 14 h）；活细胞成像间隔（7 或 10 min）阅读提示：Methods 中 Thymidine double block and live cell time-lapse microscopic image 小节；Fig. 1b, c 图注
PFKM 与柠檬酸结合验证	MST 实验蛋白浓度（1 μM）、缓冲液（100 mM Tris-HCl, pH 6.0, 0.05% Tween-20）、温度（25 °C）；突变体 K617A 阅读提示：Methods 中 MicroScale Thermophoresis (MST) assay 小节；Fig. 1i 图注
体外激酶实验	激酶缓冲液组成（10 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM MgCl2, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT）；ATP 浓度（0.5 mM 或 50 μM）；[γ−32P] ATP 用量（0.02 mCi/mL）；反应温度和时间（30 °C, 1 h）；柠檬酸预处理时间（底物 H3 前 30 min）阅读提示：Methods 中 In vitro kinase assay 小节；Fig. 3 和 Fig. 4a 图注
细胞中 H3S10 磷酸化检测	PFKM 敲除细胞回补 rPFKM WT 或突变体的表达水平验证；柠檬酸处理剂量（0.5、2.5、5 mM 等）；CS 敲低后柠檬酸回补浓度（2.5 mM）和处理时间（24 h）阅读提示：Fig. 1j, k；Fig. 2k；Fig. 4d, e；Fig. 5b, f 图注
小鼠移植瘤实验	细胞接种数量（颅内：2×10^5 个 U87/EGFRvIII 细胞/鼠；皮下：2×10^6 个 RKO 细胞/鼠）；小鼠品系和性别（雌性无胸腺裸鼠，5 或 6 周龄）；每组小鼠数量（颅内 5 或 6 只，皮下 10 只）；生物发光成像时间点（第 10、12、15 天）；肿瘤体积测量起始时间（第 14 天）和取材时间（第 25 天）阅读提示：Methods 中 Intracranial injection 和 Subcutaneous injection 小节；Fig. 5d, e, i, j, k, l 图注
T 细胞增殖实验	PBMC 激活条件（α-CD3/CD28 激活剂）；CFSE 标记浓度（1 mM）和标记时间（37 °C, 15 min）；柠檬酸处理剂量和时长（48 h）；PFKM 敲低后回补突变体阅读提示：Methods 中 T Cell proliferation 小节；Fig. 6b, c, d, h 图注

环节

核对要点

有丝分裂指数和时长检测

细胞同步化方法（胸苷双阻断：2 mM 胸苷处理 18 h，释放 9 h，再处理 18 h，释放 9.5 h）；外源柠檬酸剂量（0、0.5、2.5、5 mM）；有丝分裂指数计算时间点（释放后 14 h）；活细胞成像间隔（7 或 10 min）

阅读提示：Methods 中 Thymidine double block and live cell time-lapse microscopic image 小节；Fig. 1b, c 图注

PFKM 与柠檬酸结合验证

MST 实验蛋白浓度（1 μM）、缓冲液（100 mM Tris-HCl, pH 6.0, 0.05% Tween-20）、温度（25 °C）；突变体 K617A

阅读提示：Methods 中 MicroScale Thermophoresis (MST) assay 小节；Fig. 1i 图注

体外激酶实验

激酶缓冲液组成（10 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM MgCl2, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT）；ATP 浓度（0.5 mM 或 50 μM）；[γ−32P] ATP 用量（0.02 mCi/mL）；反应温度和时间（30 °C, 1 h）；柠檬酸预处理时间（底物 H3 前 30 min）

阅读提示：Methods 中 In vitro kinase assay 小节；Fig. 3 和 Fig. 4a 图注

细胞中 H3S10 磷酸化检测

PFKM 敲除细胞回补 rPFKM WT 或突变体的表达水平验证；柠檬酸处理剂量（0.5、2.5、5 mM 等）；CS 敲低后柠檬酸回补浓度（2.5 mM）和处理时间（24 h）

阅读提示：Fig. 1j, k；Fig. 2k；Fig. 4d, e；Fig. 5b, f 图注

小鼠移植瘤实验

细胞接种数量（颅内：2×10^5 个 U87/EGFRvIII 细胞/鼠；皮下：2×10^6 个 RKO 细胞/鼠）；小鼠品系和性别（雌性无胸腺裸鼠，5 或 6 周龄）；每组小鼠数量（颅内 5 或 6 只，皮下 10 只）；生物发光成像时间点（第 10、12、15 天）；肿瘤体积测量起始时间（第 14 天）和取材时间（第 25 天）

阅读提示：Methods 中 Intracranial injection 和 Subcutaneous injection 小节；Fig. 5d, e, i, j, k, l 图注

T 细胞增殖实验

PBMC 激活条件（α-CD3/CD28 激活剂）；CFSE 标记浓度（1 mM）和标记时间（37 °C, 15 min）；柠檬酸处理剂量和时长（48 h）；PFKM 敲低后回补突变体

阅读提示：Methods 中 T Cell proliferation 小节；Fig. 6b, c, d, h 图注

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