生物传感器设计与构建
构建基于FRET、BRET和cpGFP的APLNR构象生物传感器，并比较其性能。
将mCitrine或cpGFP插入APLNR胞内环3的四个位点（F233、R234、K235、E236）；FRET/BRET传感器C端截短至S343，cpGFP传感器保留全长C端；cpGFP两侧带LSSLI和NHDQL连接序列。
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利用基因编码的APLNR构象生物传感器在体内测量Apelin梯度
In vivo measurement of an Apelin gradient with a genetically encoded APLNR conformation biosensor.
实验完整度
高包含体外HEK293细胞系药理验证、信号通路分析及斑马鱼胚胎体内功能与机制验证
主要模型
HEK293A/HEK293T细胞系 稳定表达APLNR-cpGFP的HEK293T细胞系 斑马鱼胚胎（包括转基因品系）
重点核对
Apelin刺激浓度10 µM（FRET/BRET/cpGFP初筛） Apelin和Apela的EC50值及ML-221的IC50/Ki值 斑马鱼热激诱导配体过表达时间：5.5 hpf热激30 min，6 hpf成像；或27 hpf热激45 min，28 hpf成像 斑马鱼胚胎mRNA注射量：APLNR(K235)-cpGFP 600 pg/胚胎，膜tomato 200 pg/胚胎 稳定细胞系筛选浓度：嘌呤霉素2 µg/ml两周后降至1 µg/ml
摘要
Apelin受体（APLNR）是一种A类G蛋白偶联受体，在心血管发育和肿瘤血管生成中起关键作用。了解其在健康和疾病中的时空活性对于开发调控其激活状态的药物至关重要。为此，我们开发了基于FRET、BRET和构象敏感荧光团环化排列GFP（cpGFP）的APLNR构象生物传感器工具箱，并进一步聚焦其体内应用。我们通过体外药理学表征和信号转导分析证明了生物传感器的功能。两种APLNR-cpGFP生物传感器表现出优越的信噪比，并进一步分析了其体内适用性。在斑马鱼胚胎中，APLNR-cpGFP生物传感器能够结合两种内源性配体Apelin和Apela，并可视化生长血管中的内源性Aplnr活性。此外，我们能够在体内测量跨细胞距离的Apelin配体梯度。因此，这些APLNR构象生物传感器是解析健康和疾病中Apelin信号时空活性的有力工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何开发适用于体内的APLNR构象生物传感器，以实时监测Apelin信号的空间和时间活性？
- 核心机制
- 将cpGFP模块插入APLNR胞内环3特定位置，配体结合诱导受体构象变化，改变cpGFP荧光强度，从而报告APLNR激活状态。
- 主要证据
- 在HEK293细胞中验证cpGFP生物传感器对Apelin/Apela的剂量响应和拮抗剂效应；在斑马鱼胚胎中，生物传感器响应内源性配体，并在ISV中显示高于DA/PCV的活性，且配体敲低降低、过表达增加荧光信号；此外，测量了距Apelin源细胞不同距离的荧光梯度变化。
- 研究意义
- 这些生物传感器扩展了研究Apelin信号在健康和疾病中作用的工具箱，并具有识别和表征靶向APLNR药物的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能筛选与药理学验证
验证生物传感器对配体刺激的响应，并选择信噪比最优的传感器进行药理学表征。
在HEK293细胞中瞬时表达各传感器，用10 µM Apelin刺激，检测FRET比率、BRET比率或cpGFP荧光强度变化；对APLNR(F233)-cpGFP和APLNR(K235)-cpGFP进行Apelin和Apela的剂量响应实验及ML-221拮抗实验。
信号转导能力评估
评估生物传感器在Gi1蛋白激活和Arrestin3招募方面的信号能力。
使用Gi1-CASE BRET传感器检测Apelin刺激下Gi1异三聚体解离；使用 bystander BRET和荧光成像检测Arrestin3招募。
斑马鱼胚胎体内功能验证
验证生物传感器在体内响应配体激活并监测内源性Aplnr活性。
将APLNR(K235)-cpGFP mRNA与膜tomato mRNA共注射到单细胞期斑马鱼胚胎，利用热激诱导转基因品系过表达Apelin或Apela，共聚焦成像检测荧光变化；构建稳定转基因斑马鱼品系，在血管内皮细胞中表达生物传感器，比较ISV与DA/PCV的荧光强度；通过CRISPANT敲低apln/apela或热激过表达Apelin验证内源性活性。
体内Apelin配体梯度测量
测试生物传感器能否在体内测量Apelin配体浓度梯度。
在128细胞期将apln mRNA与Dextran-AF647共注射到单个卵裂球，6 hpf共聚焦成像，量化距Dextran阳性细胞不同距离细胞的cpGFP荧光强度。
比率型生物传感器开发与验证
开发比率型APLNR-cpGFP-mScarlet-I3生物传感器，以归一化表达水平差异。
将mScarlet-I3或p2A-mScarlet-I3融合到APLNR-cpGFP的C端，在HEK293A细胞中验证Apelin刺激下cpGFP/mScarlet-I3荧光比值变化，并注射到斑马鱼胚胎中比较ISV与DA/PCV的比值。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 配体刺激 | [Pyr1]-Apelin-13 | BACHEM | 4029110 |
| Apela(19-32) | MedChemExpress | HY-P2106A | |
| 拮抗实验 | ML-221 | Cayman chemical | Cay27313 |
| 分子克隆 | Takara PrimeStar聚合酶 | Takara | R045 |
| ClonExpress超快速一步克隆试剂盒 | Vazyme | C116 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 31966047 |
| 青霉素-链霉素混合液 | Gibco | 15140-122 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 |
| BRET检测 | furimazine储备液 | Promega | N1662 |
| 活细胞ELISA | 多克隆兔抗HA抗体 | Proteintech | #51064-2-AP |
| HRP标记的多克隆猪抗兔HRP抗体 | Dako | P0399; Lot #20058714 | |
| BMG ClarioStar Plus酶标仪 | BMG | -- | |
| Arrestin3招募BRET | 6H-F-腔肠素 | -- | -- |
| Tecan Spark 20 M酶标仪 | Tecan | -- | |
| 细胞转染 | Effectene转染试剂 | Qiagen | -- |
| 共聚焦成像 | Leica SP5共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| mRNA合成 | mMESSAGE mMACHINE SP6转录试剂盒 | Invitrogen | AM1340 |
| 斑马鱼注射 | Dextran-AlexaFluor647（10 kDa） | Invitrogen | D22914 |
| 斑马鱼麻醉 | 三卡因 | Sigma Aldrich | E10521 |
| 共聚焦成像 | Leica Stellaris 8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 整体成像 | Nikon SMZ18体视显微镜 | Nikon | -- |
| CRISPR/Cas9 | Cas9蛋白 | IDT | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外药理学验证 | Apelin和Apela的刺激浓度、EC50测定范围及ML-221的IC50/Ki值；细胞系（HEK293A vs HEK293T）和转染方式（瞬时 vs 稳定） 阅读提示：Methods中“APLNR-cpGFP measurements”和“Agonists and antagonists”小节；Fig. 2图注 |
| 斑马鱼体内配体过表达实验 | 热激时间（5.5 hpf 30 min或27 hpf 45 min）、成像时间（6 hpf或28 hpf）、mRNA注射量（APLNR(K235)-cpGFP 600 pg，膜tomato 200 pg） 阅读提示：Methods中“mRNA synthesis and microinjections”和“Tg(hsp70l:apln) or Tg(hsp70l:apela) overexpression”小节；Fig. 4和Fig. 5图注 |
| 斑马鱼CRISPANT实验 | crRNA浓度（apln 2.5 fmol，apela 0.625 fmol）、Cas9浓度（5 µM）、注射体积（文中未明确说明） 阅读提示：Methods中“crRNA design”小节；Fig. 5e,f图注 |
| Apelin梯度测量实验 | apln mRNA注射量（200 pg）、Dextran-AF647注射量（1 ng）、注射时期（128细胞期）、成像时间（6 hpf） 阅读提示：Methods中“mRNA synthesis and microinjections”小节；Fig. 6图注 |
| 比率型生物传感器体内验证 | 质粒注射量（40 pg）、tol2 mRNA量（30 pg）、成像时间（28 hpf） 阅读提示：Methods中“mRNA synthesis and microinjections”小节；Fig. 7e图注 |