鉴定DRAM1为VAMP8相互作用蛋白
寻找与VAMP8相互作用的蛋白并验证互作。
以GFP-VAMP8为诱饵进行免疫共沉淀结合质谱鉴定DRAM1；Co-IP和GST pull-down验证互作；免疫荧光观察共定位。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
DRAM1通过促进溶酶体VAMP8的稳定性增强自噬溶酶体形成并促进外渗
DRAM1 promotes the stability of lysosomal VAMP8 to enhance autolysosome formation and facilitates the extravasation.
实验完整度
高体外人细胞系、斑马鱼模型、小鼠HCC模型及TCGA数据多层级证据，含功能与机制验证
主要模型
293T和HeLa细胞系 HepG2和MHCC97H肝癌细胞系 斑马鱼幼鱼模型（含转基因GFP-Lc3品系） 小鼠HCC模型（ hydrodynamic注射及尾静脉转移模型）
重点核对
DRAM1与VAMP8相互作用及泛素化位点：Co-IP、GST pull-down及VAMP8 K68/72/75突变体 自噬溶酶体融合：RFP-GFP-LC3、体外融合实验及LysoTracker共定位 溶酶体VAMP8稳定性：Lyso-IP分离溶酶体及CHX追踪实验 HCC外渗：斑马鱼异种移植及小鼠尾静脉转移模型 自噬依赖性：ATG5或ATG7敲除/敲低后DRAM1功能丧失
摘要
自噬在应激条件下通过分解胞内成分维持能量稳态来保护细胞和生物体。溶酶体-自噬体融合是清除降解内容物的关键步骤，但自噬体与溶酶体融合的机制尚不完全清楚。本文报道DNA损伤调控自噬调节因子1（DRAM1）与囊泡相关膜蛋白8（VAMP8）相互作用，介导自噬体与溶酶体的融合。自噬刺激可增强DRAM1-VAMP8相互作用。DRAM1优先通过增强STX17-SNAP29-VAMP8复合物的组装来介导自噬体与溶酶体的融合。此外，DRAM1通过抑制CHIP介导的泛素化来阻止VAMP8降解，从而特异性促进溶酶体VAMP8的稳定性。我们还发现DRAM1通过与CHIP竞争性结合，抑制VAMP8在Lys 68、72和75位点的泛素化。进一步证明DRAM1促进肝细胞癌（HCC）细胞的外渗，该过程依赖于增强的自噬体降解。本研究揭示了DRAM1-VAMP8关联调控自噬溶酶体形成的机制，并提示了抑制HCC外渗的潜在策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DRAM1如何调控自噬体与溶酶体融合，以及该过程是否影响肝细胞癌外渗。
- 核心机制
- DRAM1与VAMP8结合，竞争性抑制CHIP对VAMP8 Lys68/72/75的泛素化，稳定溶酶体VAMP8，促进STX17-SNAP29-VAMP8复合物组装和自噬溶酶体形成。
- 主要证据
- Co-IP和GST pull-down证实DRAM1-VAMP8互作；VAMP8突变体确定泛素化位点；Lyso-IP和CHX实验显示溶酶体VAMP8稳定性；斑马鱼和小鼠模型证明DRAM1促进HCC外渗且依赖自噬。
- 研究意义
- 揭示DRAM1-VAMP8调控自噬溶酶体形成的机制，提示抑制HCC外渗的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证DRAM1对自噬溶酶体融合的功能
确定DRAM1是否促进自噬体与溶酶体融合及自噬体降解。
CRISPR/Cas9构建DRAM1 KO细胞；WB检测LC3-II和p62；RFP-GFP-LC3和体外融合实验；CQ预处理后追踪LC3-II降解；斑马鱼Dram1敲除/过表达及TEM观察自噬溶酶体。
验证DRAM1促进STX17-SNAP29-VAMP8复合物组装
探究DRAM1是否通过增强SNARE复合物组装促进融合。
Co-IP检测STX17、SNAP29、VAMP8相互结合；免疫荧光观察STX17与VAMP8共定位。
验证DRAM1稳定溶酶体VAMP8
确定DRAM1是否通过稳定VAMP8蛋白促进复合物组装。
WB检测VAMP8蛋白水平；CHX追踪降解；Lyso-IP分离溶酶体检测VAMP8；溶酶体分级分离；VAMP8敲低回复实验。
验证DRAM1抑制CHIP介导的VAMP8泛素化
揭示DRAM1稳定VAMP8的分子机制。
质谱筛选E3连接酶；Co-IP检测泛素化；CHIP敲低/过表达；VAMP8点突变确定泛素化位点；斑马鱼Chip crispant检测融合。
验证DRAM1促进HCC外渗及其自噬依赖性
确定DRAM1在体内对HCC转移外渗的作用及自噬依赖性。
Transwell迁移和侵袭实验；小鼠尾静脉转移模型；斑马鱼异种移植模型；ATG5/ATG7敲除后DRAM1功能检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Hyclone | SH30022.01 |
| 胎牛血清 | Biological Industries | 04-001-1ACS | |
| 青霉素-链霉素 | Biosharp | BL505A | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher | 11668019 |
| GenJetVer.II转染试剂 | SignaGen | SL100489 | |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A/G磁珠 | Bimake | B23202 |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | IPFL85R |
| SuperSignal West Pico化学发光底物 | Thermo Fisher | 34579 | |
| 药物处理 | 氯喹二磷酸盐 | Sangon Biotech | A506569 |
| 雷帕霉素 | Selleck | S1039 | |
| Torin 1 | MCE | HY-13003 | |
| 溶酶体分离 | Pierce抗HA磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88837 |
| 斑马鱼实验 | 三卡因 | Sigma-Aldrich | -- |
| LysoTracker染色 | LysoTracker Red | Solarbio | L8010 |
| Transwell实验 | 基质胶 | BD Biocoat | 354234 |
| 小鼠活体成像 | D-荧光素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 自噬诱导处理 | EBSS处理时间、Torin1浓度（100 nM）、Rapamycin浓度（10 nM）、CQ浓度（细胞10 μM，斑马鱼20 μM） 阅读提示：Methods中Drug treatments小节 |
| CHX追踪实验 | CHX浓度20 μg/mL、处理时间点 阅读提示：Methods中Drug treatments小节及图4E、4K图注 |
| 泛素化实验 | MG132浓度10 μM处理6 h、转染48 h 阅读提示：图6D图注及Methods中Immunoprecipitation and Western blot小节 |
| 小鼠HCC模型 | 8周龄C57BL/6小鼠、质粒比例10:1、注射体积2 mL、5周后检测 阅读提示：Methods中Hydrodynamic tail vein Myc/AKT, N-RAS/AKT HCC mouse model小节 |
| 小鼠尾静脉转移模型 | 5周龄裸鼠、每只注射3×10^6细胞、5周或3周后检测 阅读提示：Methods中Lung metastasis assays in nude mice小节 |
| 斑马鱼异种移植 | 注射细胞数约300或100、注射日龄2 dpf、检测时间点2-3 dpi、养殖温度34°C 阅读提示：Methods中Injection of HCC tumor cells into zebrafish小节 |
| 体外自噬体-溶酶体融合实验 | ATP再生系统组成、37°C孵育2 h、离心条件 阅读提示：Methods中In vitro autophagosome-lysosome fusion assay and image quantification小节 |