建立naive报告细胞系与cDNA文库筛选
筛选能促进兔iPSCs向naive状态转化的基因组合
构建DPPA2-mKO2和EOS-tagBFP双荧光报告NaiveRep细胞，转导人cDNA文库，在KF、FCS+LIF、KOSR+LIF或VALGöX条件下筛选荧光激活克隆，PCR鉴定原病毒整合。
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利用兔诱导多能干细胞在非啮齿类物种中高效生成生殖系嵌合体
Efficient generation of germline chimeras in a non-rodent species using rabbit induced pluripotent stem cells.
实验完整度
高体外iPSC重编程与胚胎定植、体内嵌合胎儿/新生兔/成体、生殖系传递及多组学验证
主要模型
兔iPSC系B19及其衍生KEPc/KEPi细胞 兔早期桑葚胚（E2.8） 嵌合胎儿（E10.5/E14）与新生/成年嵌合兔
重点核对
cDNA文库筛选：2.4×10^5 NaiveRep细胞，MOI 50或15，转导后培养7天筛选荧光克隆 KEP三基因组合：KLF2、ERAS、PRMT6共表达，验证长期自我更新和CD75高表达 胚胎注射：每个桑葚胚注射8个细胞，体外培养3天或移植代孕母兔 生殖系传递：嵌合雌兔与野生型雄兔交配，E14胚胎GFP PCR及整合位点分析 嵌合率定量：qPCR检测GFP标准化TBP，免疫荧光验证组织贡献
摘要
多能干细胞长期以来被用于通过生殖系嵌合技术产生基因敲除小鼠。然而，除了大鼠之外，这种方法尚未成功应用于其他哺乳动物。在此，我们证明兔诱导多能干细胞（iPSCs）可以通过KLF2、ERAS和PRMT6进行重编程，使其能够高效地定植胚胎。这些嵌合胚胎可以发育成胎儿和新生兔，iPSCs对某些器官的贡献高达100%。值得注意的是，通过这种方法产生的雌兔是健康的，并以高效率将iPSC基因组传递给后代，证明了生殖系嵌合。这一进展为开发具有复杂遗传特征的人类疾病兔模型奠定了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否在兔这一非啮齿类哺乳动物中利用iPSCs高效生成生殖系嵌合体？
- 核心机制
- KLF2、ERAS和PRMT6过表达联合VALGöX培养条件协同将兔iPSCs重编程至功能性naive样状态，增强胚胎定植和生殖系贡献能力。
- 主要证据
- cDNA文库筛选鉴定KLF2/ERAS/PRMT6组合；KEPc/KEPi细胞在嵌合胚胎、胎儿、新生兔中多器官贡献；CD75high亚群高效定植并传递GFP标记至F1胚胎。
- 研究意义
- 为开发具有复杂遗传特征的人类疾病兔模型奠定基础，并提供研究naive pluripotency和胚胎定植的细胞工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证KLF2/ERAS/PRMT6组合对naive状态的维持
确定KLF2、ERAS、PRMT6单独或组合对兔iPSCs自我更新和naive标志的影响
用PiggyBac载体在B19细胞中过表达KLF2-V5、HA-ERAS、Flag-PRMT6，在VALGöX中筛选耐药克隆，传代10次后分析形态、CD75表达、H3K27me3/H2AK119Ub核焦点及转录组。
评估KEP细胞胚胎定植能力
比较KEPc_KF、KEPc_VAL及亲本B19_KF细胞注入桑葚胚后的定植效率
将8个细胞显微注射到E2.8兔桑葚胚，体外培养3天至晚期囊胚，计数GFP+细胞及SOX2共表达。
建立可逆KEP表达系统并验证体内定植
通过Shield1调控KEP表达，研究转基因消退对嵌合能力的影响
构建DD融合的KLF2、ERAS、PRMT6载体，转染B19-GFP细胞，在VALGöX+Shield1中建立KEPi细胞，撤除Shield1后检测蛋白降解、转录组变化及胚胎定植。
分选CD75high亚群并验证胎儿和成体贡献
确定CD75high亚群的胚胎定植和生殖系传递能力
流式分选KEPi#28_VAL+S中CD75high细胞，注射到桑葚胚，培养24h后移植代孕母兔，收集E10.5胎儿和新生兔，分析GFP+组织及生殖系传递。
转录组分析胚胎定植相关特征
识别与增强胚胎定植能力相关的转录组特征和信号通路
对B19_KF、B19_VAL、KEPc_KF、KEPc_VAL及KEPi_VAL+S/S-S细胞进行RNA-seq，比较差异表达基因，KEGG通路富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 基质胶 | -- | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| G418 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 潮霉素 | -- | -- | |
| Shield1 | -- | -- | |
| 成纤维细胞生长因子2 | -- | -- | |
| 白血病抑制因子 | -- | -- | |
| Gö6983 | -- | -- | |
| XAV939 | -- | -- | |
| 激活素A | -- | -- | |
| 维生素C | -- | -- | |
| 病毒生产 | pMD2G质粒 | Addgene | #12259 |
| psPAX2质粒 | Addgene | #12260 | |
| 病毒转导 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 免疫荧光 | 抗SOX2抗体 | Bio-Techne | AF2018 |
| 抗GFP抗体 | Invitrogen | A10262 | |
| 抗OCT4抗体 | StemAB | 09-0023 | |
| 抗DPPA5抗体 | R&D systems | AF3125 | |
| 抗OOEP抗体 | Abcam | 185478 | |
| 抗泛素化组蛋白H2A Lys119抗体 | Cell Signaling | #8240 | |
| 抗三甲基化组蛋白H3 Lys27抗体 | Cell Signaling | #9733 | |
| 抗三甲基化组蛋白H3 Lys4抗体 | Cell Signaling | #9751 | |
| 抗乙酰化组蛋白H3 K14抗体 | Abcam | ab52946 | |
| 抗三甲基化组蛋白H3 K9抗体 | Abcam | ab8898 | |
| 抗不对称二甲基化组蛋白H3 R2抗体 | Abcam | ab175007 | |
| 抗5-甲基胞嘧啶抗体 | EMD Millipore | MABE146 | |
| 抗CD75抗体 | Abcam | ab77676 | |
| 驴抗山羊（Alexa Fluor 555） | Invitrogen | A21432 | |
| 驴抗鸡（Alexa Fluor 488） | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
| 驴抗小鼠（Alexa Fluor 647） | Invitrogen | A21448 | |
| 驴抗兔（Alexa Fluor 555） | Invitrogen | A31572 | |
| 驴抗兔（Alexa Fluor 647） | Invitrogen | A31573 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 含DAPI的Vectashield封片剂 | Vectorlabs | H-1200-10 | |
| 抗TUJ1抗体 | Sigma | T8660 | |
| 抗平滑肌肌动蛋白抗体 | Millipore | CBL171 | |
| 抗层粘连蛋白抗体 | Sigma | I9393 | |
| 抗PAX3抗体 | DSHB | 3929 | |
| 抗CD31/PECAM-1抗体 | Bio-techne | AF806 | |
| 抗结蛋白抗体 | Abcam | ab32362 | |
| 抗SOX17抗体 | Bio-Techne | AF1924 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗鸡 | Abcam | ab150169 | |
| Alexa Fluor 647驴抗小鼠IgG | Invitrogen | A21448 | |
| Alexa Fluor 647驴抗山羊IgG | Invitrogen | A21447 | |
| Alexa Fluor 647驴抗兔IgG | Invitrogen | A31573 | |
| Western blot | 抗V5标签抗体 | Invitrogen | R96025 |
| 抗HA抗体 | Sigma-Aldrich | H6908 | |
| 抗Akt（pan）抗体 | Cell Signaling | #4691 | |
| 抗磷酸化Akt（Ser473）抗体 | Cell Signaling | #4060 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A3854 | |
| Mini-PROTEAN TGX免染预制胶 | Biorad | #4568031 | |
| Precision Plus Protein双色标准品 | Biorad | #1610374 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Midi 0.2 µm硝酸纤维素转印试剂盒 | Biorad | #1704271 | |
| Clarity Western ECL底物 | Biorad | #170-5060 | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Biorad | -- | |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | #05 892 970 001 | |
| 基因组PCR | Quick-Load Taq 2X预混液 | NEB | M0271S |
| Q5热启动高保真DNA聚合酶 | NEB | M0493S | |
| QIAamp DNA迷你试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 定量PCR | Fast SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | 4385612 |
| RNA提取 | RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | #74106 |
| DNase I | Qiagen | #79254 | |
| cDNA合成 | High-Capacity RNA-to-cDNA试剂盒 | Invitrogen | 4387406 |
| RNA测序 | SMART-Seq V4超低输入RNA试剂盒 | Clontech | -- |
| Nextera XT Illumina文库制备试剂盒 | -- | -- | |
| Illumina NextSeq500测序仪 | Illumina | -- | |
| 流式细胞术 | LSRFortessa X-20细胞分析仪 | Beckton Dickinson | -- |
| FACSAria III分选仪 | Beckton Dickinson | -- | |
| Alexa Fluor Plus 647偶联的山羊抗小鼠IgG二抗 | Invitrogen | A32728 | |
| 核型分析 | KaryoMAX秋水仙胺 | Invitrogen | -- |
| 连接介导PCR | MseI限制酶 | NEB | #R0525S |
| SacI限制酶 | NEB | #R3156S | |
| KpnI限制酶 | Thermo Scientific | FD0524 | |
| HincII限制酶 | NEB | #R0103S | |
| Accuprime富含GC DNA聚合酶 | Thermo Fischer | #12337024 | |
| pJET1.2质粒 | Thermo Fischer | #K1232 | |
| 10-beta感受态大肠杆菌 | NEB | #C3019 | |
| 胚胎培养 | RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Ham's F10培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 链霉蛋白酶 | -- | -- | |
| 荧光成像 | TiS荧光显微镜 | Nikon | -- |
| 共聚焦成像 | DM 6000 CS SP5共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| qPCR | Step One plus实时PCR系统 | -- | -- |
| DNA定量 | Nanodrop 2000分光光度计 | -- | -- |
| 细胞培养 | pFucci-G1 Orange质粒 | MBL Life Science | AM-V9003M |
| pMA-PGK-neo质粒 | GeneArt LifeTechnologies | -- | |
| Gibson组装预混液 | NEB | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| cDNA文库筛选 | NaiveRep细胞数量2.4×10^5，MOI 50或15，转导后培养7-10天，荧光克隆筛选标准 阅读提示：Methods 'Virus production, cell infection, and cDNA library screening'及Fig. 2a |
| KEP三基因过表达 | KLF2-V5、HA-ERAS、Flag-PRMT6载体序列及转染用量，筛选抗生素浓度，传代次数 阅读提示：Methods 'Plasmid constructs'和'Media composition, culture, and electroporation'，Supplementary Fig. S3a |
| 胚胎显微注射与移植 | 每个桑葚胚注射8个细胞，E2.8阶段，体外培养24h或3天，每只代孕母兔移植胚胎数 阅读提示：Methods 'Cell microinjection, embryo culture, and embryo transfer'，Table 1 |
| CD75high细胞分选 | 分选top 2.1%-3.5% CD75high细胞，分选后培养24h或5天再注射 阅读提示：Results 'High-CD75 KEP cells show very high chimeric competence'，Fig. 6a,b |
| Shield1诱导KEP表达 | Shield1浓度10-1000 nM，撤除Shield1 7天验证蛋白降解 阅读提示：Methods 'Media composition, culture, and electroporation'及Fig. 5a |
| 嵌合率定量 | qPCR标准曲线制备（0%-100% GFP混合DNA），每个组织取5个位点，TBP内参 阅读提示：Methods 'Genomic PCR amplification of transgenes and GFP integration site on rabbit chromosome 1'及Supplementary Table 2 |
| 生殖系传递分析 | 嵌合雌兔与野生型雄兔交配，E14收集胚胎，GFP PCR及LM-PCR整合位点分析 阅读提示：Results 'High-CD75 KEP cells generate germline chimeras'，Fig. 7e-h，Table 2 |