结构分析与突变位点选择
基于Jun12682与PLpro的共晶结构，识别药物结合位点中可能影响耐药性的关键残基。
分析Jun12682和PF-07957472与PLpro的X射线晶体结构（PDB: 8UOB和9CSY），确定直接相互作用的残基（M208、P247、P248、Y264、Y268、Q269、D164、E167），并从GISAID数据库获取这些残基的高频天然突变。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶天然耐药突变的鉴定
Identification of naturally occurring drug-resistant mutations of SARS-CoV-2 papain-like protease.
实验完整度
高包含体外酶学、DSF结合、病毒传代、重组病毒表型及MD模拟等多层级证据，并有功能验证。
主要模型
SARS-CoV-2 PLpro野生型及突变体蛋白 SARS-CoV-2 USA-WA1/2020株 重组SARS-CoV-2-nLuc PLpro突变病毒 Vero-AT细胞
重点核对
PLpro突变体酶活性kcat/Km相对于WT的变化倍数（阈值：<10倍变化） PLpro突变体对Jun12682和PF-07957472的抑制常数Ki相对于WT的变化倍数（阈值：>10倍增加） 连续传代实验中Jun12682浓度从1 µM起始，每两代加倍至32 µM，共传12代 病毒竞争实验：WA1与Lineage 3 P11按1:1 PFU比例混合，在0或32 µM Jun12682存在下传4代 重组PLpro突变病毒的EC50通过空斑减少实验测定
摘要
SARS-CoV-2木瓜样蛋白酶（PLpro）是一种半胱氨酸蛋白酶，可切割病毒多聚蛋白并在病毒复制过程中拮抗宿主免疫应答。Jun12682和PF-07957472是首批在 mouse 模型中显示出强效体内抗病毒活性的PLpro抑制剂。本研究表征了位于Jun12682药物结合位点残基上的天然存在突变。结果显示，若干PLpro突变体表现出显著耐药性，同时保持与野生型PLpro相当的酶活性。通过独立的连续病毒传代实验验证了所鉴定耐药突变体（包括E167G和Q269H）的生理相关性。分子动力学模拟和微扰自由能计算表明，耐药PLpro突变体削弱了氢键和π-π堆积相互作用。总之，本研究确定了E167、Y268和Q269为结合BL2环和沟槽区域的PLpro抑制剂的耐药热点，这对于指导下一代PLpro抑制剂的设计具有重要价值。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2 PLpro药物结合位点的天然存在突变是否会导致对PLpro抑制剂Jun12682和PF-07957472的耐药性，以及哪些残基是耐药热点？
- 核心机制
- PLpro突变（如E167G、Y268H、Q269H）通过削弱抑制剂与PLpro之间的氢键和π-π堆积相互作用导致耐药，同时保持与野生型相当的酶活性。
- 主要证据
- 体外酶学实验和DSF结合实验显示E167G/K/A/S/V、Y268H/N和Q269H突变体对Jun12682和PF-07957472的Ki增加>10倍且kcat/Km变化<10倍；连续病毒传代实验独立筛选出E167G和Q269H突变；重组PLpro突变病毒的空斑实验显示EC50增加；MD模拟和TI/MD自由能计算显示突变体减弱了氢键和π-π堆积相互作用。
- 研究意义
- 本研究确定E167、Y268和Q269为结合BL2环和沟槽区域的PLpro抑制剂的耐药热点，有助于指导下一代PLpro抑制剂的设计，并提示应密切监测携带这些突变的SARS-CoV-2流行株。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PLpro突变体表达纯化与稳定性检测
获得突变体蛋白并评估其结构稳定性是否受影响。
通过定点突变构建34个PLpro突变体，在BL21细胞中表达并纯化，使用DSF assay检测热稳定性。
酶活性与耐药性生化表征
测定突变体的酶催化效率和对抑制剂的敏感性，筛选生理相关耐药突变。
使用FRET底物（Dabcyl-FTLRGG/APTKV(Edans)）测定kcat/Km，通过滴定化合物浓度测定Ki，并用DSF结合实验验证。
连续病毒传代筛选耐药突变
在药物选择压力下验证结构预测的耐药突变是否在病毒复制中实际出现。
将SARS-CoV-2 USA-WA1/2020株在递增浓度Jun12682存在下连续传代12次，每两代测序PLpro编码区。
病毒竞争实验评估适应性
评估传代筛选到的突变病毒相对于野生型病毒的适应性。
将Lineage 3 P11病毒与野生型WA1按1:1比例混合，在有无32 µM Jun12682条件下传代4次，监测突变频率变化。
重组PLpro突变病毒构建与表型鉴定
在传染性克隆中引入PLpro突变，验证其对病毒复制和药物敏感性的影响。
构建携带E167G、Y268H、Q269H单突变及L152F/Q269H、E167G/Q269H双突变的重组SARS-CoV-2-nLuc病毒，进行空斑实验、生长动力学和EC50测定。
分子动力学模拟与自由能计算
从分子水平解释突变导致耐药的机制。
对PLpro WT及E167G、Y268H、Q269L、Q269H、E167G/Q269H突变体与Jun12682的复合物进行500 ns MD模拟，分析相互作用变化，并用TI/MD方法计算相对结合自由能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证酶活性与药物敏感性
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 定点突变 | QuikChange II定点突变试剂盒 | Agilent | -- |
| 蛋白表达 | 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | -- | -- |
| 蛋白纯化 | 镍螯合树脂 | Biosciences | -- |
| SUMO蛋白酶I | -- | -- | |
| FRET酶学实验 | Dabcyl-FTLRGG/APTKV(Edans) FRET底物 | -- | -- |
| BioTek Cytation 5成像读取仪 | Agilent | -- | |
| Ub-AMC和ISG15-AMC酶学实验 | 重组人泛素-AMC | R&D Systems | U-550 |
| 重组人ISG15-AMC | R&D Systems | UL-553 | |
| DSF实验 | SUPRO橙色染料 | Thermo Scientific | -- |
| QuantStudio 5实时PCR系统 | ThermoFisher | -- | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | InVivogen | ant-pr-1 |
| 杀稻瘟菌素 | InVivogen | ant-bl-05 | |
| 病毒滴定 | 琼脂糖 | Fisher | M26944 |
| 重组病毒构建 | Q5定点突变试剂盒 | NEB | E0554S |
| T4 DNA连接酶 | NEB | M0202L | |
| mMESSAGE mMACHINE T7转录试剂盒 | ThermoFisher | AM1344 | |
| 病毒生长动力学实验 | Nano-Glo荧光素酶实验 | Promega | G9243 |
| GloMax Discover微孔板读取仪 | Promega | GM3000 | |
| 抗病毒空斑实验 | Avicel微晶纤维素 | FMC polymers | -- |
| P-糖蛋白抑制剂CP-100356 | -- | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Thermo Fisher | 15-596-026 |
| 逆转录 | LunaScript逆转录预混液 | New England Biolabs | E3010L |
| PCR扩增 | Q5热启动高保真2×预混液 | New England Biolabs | M0494L |
| PCR产物纯化 | Wizard SV凝胶和PCR清洁试剂盒 | Promega | A9282 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 连续病毒传代实验 | 起始Jun12682浓度1 µM（2×EC50），每两代加倍，最终32 µM；传代12次；三重复独立传代；Vero-AT细胞；感染量0.01 PFU/细胞 阅读提示：Methods 'In vitro selection for SARS-CoV-2 resistance to Jun12682'及Fig. 6a |
| 病毒竞争实验 | WA1与Lineage 3 P11按1:1 PFU混合；0.01 MOI感染；32 µM Jun12682；传代4次；Vero-AT细胞 阅读提示：Methods 'Virus competition experiment'及Fig. 6c |
| FRET酶学实验 | FRET底物Dabcyl-FTLRGG/APTKV(Edans)浓度20 µM用于Ki测定；PLpro浓度经优化以保证至少1小时线性初速度；Morrison方程拟合 阅读提示：Methods 'FRET-based enzymatic assay' |
| DSF结合实验 | 蛋白浓度4 µM；化合物孵育30分钟 at 30°C；升温速率0.05°C/s from 25°C to 95°C；SUPRO orange染料1× 阅读提示：Methods 'Differential scanning fluorimetry (DSF) assay' |
| 重组PLpro突变病毒抗病毒实验 | Vero-AT细胞；感染量50 PFU/孔；化合物3倍系列稀释，起始浓度10 µM（rSARS-CoV-2-nLuc）或30 µM（PLpro突变体）；孵育48小时；ImageJ定量感染面积 阅读提示：Methods 'Antiviral assays with infectious SARS-CoV-2'及Fig. 6g-i |
| MD模拟与TI/MD计算 | MD模拟500 ns，ff19sb力场；TI/MD 11个λ值，ff14sb力场；起始结构PDB 8UOB；每个复合物两次重复 阅读提示：Methods 'MD simulations'和'TI/MD calculations protocol' |