临床病理特征记录
描述患者病史、影像学、生化及病理特征
记录患者72岁女性，复发性PCC伴腹膜种植，通过CT、MRI、68Ga-DOTATATE PET/CT及18F-DOPA PET/CT显示多处病灶，生化检测显示儿茶酚胺代谢物升高。
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新型GLCCI1-BRAF融合在嗜铬细胞瘤病一例中驱动激酶信号传导
Novel GLCCI1-BRAF fusion drives kinase signaling in a case of pheochromocytomatosis
实验完整度
中包含患者样本NGS/FISH/IHC检测、体外细胞转染Western blot验证，但仅有单个病例且无动物模型或功能回补实验。
主要模型
HEK-293细胞 患者肿瘤组织样本
重点核对
患者为72岁女性，嗜铬细胞瘤病，多处腹膜种植灶 NGS检测到GLCCI1 exon 3-BRAF exon 9框内融合，BRAF激酶结构域完整 FISH检测BRAF断裂分离信号阳性（46%细胞核） HEK-293细胞转染GLCCI1-BRAF融合，Western blot检测pMEK、SNAI1、ZEB1
摘要
引言：复发性和转移性嗜铬细胞瘤(PCC)是一种罕见的晚期内分泌肿瘤，治疗选择有限。深入了解晚期PCC患者的致病性分子改变，可以为精准靶向失调通路提供治疗选择。目的：我们报告在一例复发性嗜铬细胞瘤伴腹膜种植(嗜铬细胞瘤病)患者中发现并鉴定了一种新型含BRAF的融合转录本及其下游分子改变。方法：我们回顾了一位嗜铬细胞瘤病患者的病史。对手术标本进行了全面的泛癌分子谱分析(使用二代测序NGS)以及验证性RT-qPCR。分别使用荧光原位杂交(FISH)和免疫组织化学(IHC)检测BRAF重排和下游分子变化。使用Western blot评估转染的HEK-293细胞中MAPK信号通路和EMT标志物的体外激活情况。结果：对一位72岁女性嗜铬细胞瘤病患者的标本进行NGS分析，显示糖皮质激素诱导蛋白1(GLCCI1)外显子3与BRAF外显子9发生框内融合。GLCCI1-BRAF融合中排除了BRAF上游自抑制结构域，但保留了完整的BRAF下游激酶结构域。通过BRAF特异性断裂分离FISH实验证实了BRAF重排。四个独立的肿瘤灶均携带GLCCI1-BRAF融合。IHC显示磷酸化MEK增加。转染GLCCI1-BRAF融合的HEK-293细胞在体外表现出磷酸化MEK增加以及EMT标志物SNAI1和ZEB1表达升高。结论：我们证明了一种新的致病性基因融合，即GLCCI1与BRAF致癌激酶结构域融合，导致MAPK信号通路和EMT标志物激活。因此，当需要全身治疗时，该患者可能受益于临床上可用的MEK和/或BRAF抑制剂。关键词：BRAF，GLCCI1，嗜铬细胞瘤，嗜铬细胞瘤病。总结：本报告是人肿瘤中GLCCI1与BRAF融合的首例报道，也是PCC中第二个含BRAF的融合转录本。对PCC进行详细的分子特征分析，可能是处理复发性PCC和嗜铬细胞瘤病(构成重大临床挑战)患者的有价值工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 复发性嗜铬细胞瘤病患者的致病性分子改变是什么？
- 核心机制
- GLCCI1-BRAF融合导致BRAF自抑制结构域缺失，保留完整激酶结构域，构成性激活MAPK信号通路，并上调EMT标志物SNAI1和ZEB1。
- 主要证据
- NGS检测到融合转录本，FISH确认BRAF重排，IHC显示pMEK增高，体外HEK-293细胞转染实验证实下游信号激活。
- 研究意义
- 该发现为患者提供了潜在的治疗靶点，可考虑使用MEK和/或BRAF抑制剂。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
NGS融合检测
识别肿瘤中的驱动基因突变
使用TruSight Oncology 500（TSO-500）对FFPE组织标本进行NGS，鉴定出GLCCI1-BRAF融合。
FISH验证BRAF重排
在基因组水平确认BRAF基因重排
使用BRAF特异性断裂分离FISH探针检测FFPE组织中的BRAF重排。
RT-qPCR验证融合转录本
确认融合转录本在多个肿瘤灶中的存在
从四个额外肿瘤标本及原检测标本中提取RNA，通过RT-qPCR检测GLCCI1-BRAF融合，并测序确认融合点。
IHC检测下游信号激活
评估MAPK通路在肿瘤组织中的激活状态
对肿瘤切片进行pMEK免疫组化染色，与VHL驱动的PCC标本比较。
细胞转染Western blot验证
体外验证GLCCI1-BRAF融合蛋白的功能
构建FLAG标签的GLCCI1-BRAF表达质粒，转染HEK-293细胞，48小时后Western blot检测BRAF、pMEK、SNAI1、ZEB1表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| NGS | TruSight Oncology 500 DNA试剂盒 | Illumina | 20028214 |
| FISH | BRAF特异性断裂分离FISH检测 | NeoGenomics Laboratories | -- |
| IHC | 抗磷酸化MEK抗体 (166F8) | Cell Signaling Technology | -- |
| SignalStain® Boost IHC检测试剂 | Cell Signaling Technology | 8114S | |
| IHC显微镜 | 蔡司Axio Observer D1显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | -- |
| 质粒构建 | Q5高保真DNA聚合酶 | New England Biolabs | -- |
| In-Fusion克隆试剂盒 | Takara, Inc | -- | |
| NEB Stable细胞 | New England Biolabs | -- | |
| 细胞培养 | HEK-293细胞 | American Type Culture Collection | CRL-1573 |
| 极限必需培养基 | Corning | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine® 3000转染试剂盒 | Invitrogen | -- |
| OPTI-MEM®减血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | Pierce™ BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗FLAG抗体 (F3165) | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抗磷酸化MEK抗体 (166F8) | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗MEK抗体 (L38C12) | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗SNAI1抗体 (3879S) | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗ZEB1抗体 (3396T) | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗p84抗体 (GTX7002) | GeneTex | -- | |
| HRP偶联抗GAPDH抗体 (D16H11) | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗β-actin抗体 (12262S) | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗兔IgG HRP偶联二抗 (7074S) | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗鼠IgG HRP偶联二抗 (7076S) | Cell Signaling Technology | -- | |
| 增强化学发光试剂 (Pierce™) | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RT-qPCR | RNeasy FFPE提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| SuperScript IV第一链合成系统 | Thermo Fisher | -- | |
| TaqMan Fast Advanced预混液 | Thermo Fisher | -- | |
| ViiA™ 7实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystem | -- | |
| GLCCI1 e3B探针 | -- | 6-FAM/TAMRA | |
| 测序 | MyTaq DNA聚合酶 | Meridian Biosciences | -- |
| TOPO TA克隆试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| 5-alpha感受态大肠杆菌 | New England Biolabs | -- | |
| 桑格测序 | Eurofins Genomics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| NGS | 样本类型：FFPE组织；检测平台：TSO-500；RNA提取试剂盒 阅读提示：Methods: TruSight Oncology 500 assay |
| FISH | 阳性标准：≥9%细胞核有分离信号；检测的细胞核数 阅读提示：Methods: BRAF break apart assay; Results: Confirmation of BRAF gene rearrangement |
| IHC | 一抗：抗pMEK (166F8) 1:50稀释；孵育条件：4°C过夜 阅读提示：Methods: Immunohistochemistry |
| 质粒构建 | GLCCI1-BRAF片段来源；克隆载体：pcDNA3.1；使用的酶和试剂（In-Fusion， Q5聚合酶） 阅读提示：Methods: Plasmid construction |
| 细胞培养与转染 | 细胞系：HEK-293 (CRL-1573)；培养基：MEM+10% FBS；转染试剂：Lipofectamine 3000 阅读提示：Methods: Cell Culture, Transient Transfection |
| Western blot | 检测时间点：转染后48小时；裂解液和定量方法（BCA）；抗体稀释比例：1:1000 阅读提示：Methods: Western Blot Analysis |
| RT-qPCR | 引物探针序列：GLCCI1 e3A/BRAF e10A, GLCCI1 e3B；反应条件：95°C 20秒，45个循环（95°C 1秒，60°C 20秒）；内参：GAPDH 阅读提示：Methods: Real-Time-quantitative PCR (RT-qPCR) and sequencing; Table 1 |