验证AML细胞对丝氨酸/甘氨酸（SG）剥夺的依赖性
确定AML细胞是否依赖外源丝氨酸/甘氨酸以及胞内丝氨酸合成。
在完全培养基（CM）或去除丝氨酸和甘氨酸（-SG）的培养基中培养人AML细胞系，检测生长曲线；用MLL-AF9转导小鼠HSPC进行集落形成实验；用PHGDH抑制剂NCT-503处理AML细胞，检测对SG剥夺的敏感性。
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m6A/IGF2BP3驱动的丝氨酸生物合成维持AML干性及代谢脆弱性
m6A/IGF2BP3-driven serine biosynthesis fuels AML stemness and metabolic vulnerability.
实验完整度
高CRISPR/Cas9筛选、代谢组、RNA-seq、RIP/MeRIP、多种AML细胞系、PDX、小鼠BMT及KO模型，包含功能与机制验证
主要模型
Molm13、NB4、U937、MM6人AML细胞系 患者来源CD34+ AML细胞及PDX模型 MLL-AF9转导小鼠HSPC及BMT小鼠模型 Igf2bp3敲除小鼠
重点核对
Molm13-Cas9细胞在完全培养基或去除丝氨酸和甘氨酸（-SG）培养基中培养至8、12、17个群体倍增，sgRNA文库MOI<0.3 IGF2BP3或METTL14敲低/敲除后，AML细胞在CM或-SG培养基中的生长曲线及集落形成能力 BP3-mAID细胞经5’Ph-IAA（1 μM，体外）处理诱导IGF2BP3快速降解，检测对SG剥夺的敏感性 RIP-qPCR和MeRIP-qPCR验证IGF2BP3结合及m6A修饰对ATF4、PHGDH、PSAT1 mRNA的调控 BMT实验中供体细胞数量（0.1–0.2×10^6）及辅助细胞（1×10^6），受体小鼠辐照剂量（致死5 Gy+5 Gy；亚致死4.5 Gy）
摘要
氨基酸代谢重编程是癌细胞的一种脆弱性，然而急性髓系白血病（AML）和白血病干/起始细胞（LSCs/LICs）中丝氨酸代谢的机制尚不清楚。在此，我们鉴定RNA N6-甲基腺苷（m6A）修饰是AML中丝氨酸生物合成的关键调控因子。通过CRISPR/Cas9筛选，我们发现m6A调控因子IGF2BP3或METTL14的缺失使AML细胞对丝氨酸和甘氨酸（SG）剥夺敏感。IGF2BP3识别关键丝氨酸合成通路（SSP）基因（如ATF4、PHGDH、PSAT1）mRNA上的m6A，稳定这些转录本并维持丝氨酸产生以满足AML细胞和LSCs/LICs的高代谢需求。IGF2BP3沉默联合饮食SG限制在体外和体内有效抑制AML，而其缺失不影响正常造血。我们的发现揭示了m6A修饰在AML丝氨酸代谢脆弱性中的关键作用，并强调IGF2BP3/m6A/SSP轴作为有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AML和白血病干/起始细胞（LSCs/LICs）中丝氨酸代谢的调控机制尚不清楚，本研究旨在探究m6A修饰是否参与调控AML的丝氨酸代谢及其在维持干性和白血病发生中的作用。
- 核心机制
- IGF2BP3作为m6A阅读蛋白，识别ATF4、PHGDH和PSAT1 mRNA上的m6A修饰，增强这些转录本的稳定性，从而促进丝氨酸合成通路（SSP）和丝氨酸产生，维持AML细胞及LSCs/LICs的代谢需求。
- 主要证据
- 通过CRISPR/Cas9筛选发现IGF2BP3和METTL14缺失使AML细胞对SG剥夺敏感；代谢组学和RNA-seq证实IGF2BP3调控丝氨酸生物合成；RIP和MeRIP-qPCR验证IGF2BP3直接结合m6A修饰的ATF4、PHGDH、PSAT1 mRNA并促进其稳定性；过表达这些靶基因可部分挽救IGF2BP3缺失导致的生长抑制、凋亡和丝氨酸水平下降；小鼠BMT和KO模型证明Igf2bp3促进AML发生和LSC/LIC自我更新，且不影响正常造血。
- 研究意义
- 揭示m6A修饰在AML丝氨酸代谢脆弱性中的关键作用，证明IGF2BP3/m6A/SSP轴是AML的潜在治疗靶点，且靶向IGF2BP3联合SG限制具有协同抗白血病效果，同时保留正常造血功能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CRISPR/Cas9表观遗传筛选鉴定调控SG剥夺敏感性的基因
筛选缺失后使AML细胞对SG剥夺敏感的的表观遗传基因，发现m6A通路的作用。
在Molm13-Cas9细胞中感染靶向423个表观遗传基因的sgRNA文库，在CM或-SG培养基中培养至8、12、17个群体倍增，深度测序sgRNA丰度，计算SG依赖性评分。
验证IGF2BP3和METTL14对SG剥夺敏感性的调控
验证筛选结果，确认IGF2BP3/METTL14缺失增强AML细胞对SG剥夺的敏感性。
构建靶向IGF2BP3或METTL14的sgRNA/shRNA，感染AML细胞，在CM或-SG培养基中检测生长曲线；利用AID2系统在BP3-mAID细胞中经5’Ph-IAA诱导IGF2BP3快速降解，检测对SG剥夺的敏感性。
代谢组学和转录组学分析IGF2BP3对丝氨酸生物合成的调控
探究IGF2BP3是否调控丝氨酸合成及下游代谢。
在IGF2BP3敲低的Molm13细胞中，用U-[13C]-葡萄糖孵育过夜，LC-MS检测代谢物；用荧光法检测细胞内丝氨酸水平；对IGF2BP3敲低或降解的细胞进行RNA-seq，分析差异表达基因及m6A修饰。
验证IGF2BP3通过m6A依赖方式直接调控ATF4、PHGDH、PSAT1
确定IGF2BP3是否直接结合并稳定m6A修饰的SSP基因mRNA。
用RIP-qPCR检测IGF2BP3与靶mRNA的结合；用MeRIP-qPCR和BST-qPCR检测m6A修饰水平；用放线菌素D实验检测mRNA半衰期；用Western blot检测蛋白表达；过表达野生型或KH3-4突变型IGF2BP3，检测对靶基因的调控。
验证ATF4、PHGDH、PSAT1在IGF2BP3功能中的介导作用
确定ATF4、PHGDH、PSAT1是否为IGF2BP3下游功能性靶点。
在IGF2BP3敲低的AML细胞中过表达ATF4、PHGDH或PSAT1，检测细胞生长、凋亡、集落形成及丝氨酸水平；在小鼠HSPC中敲低这些靶基因，检测集落形成和干性。
体内验证Igf2bp3在AML发生和维持中的作用
确定Igf2bp3对AML白血病发生和LSC/LIC自我更新的体内功能。
用shRNA敲低或CRISPR/Cas9敲除Igf2bp3，转导MLL-AF9至小鼠HSPC，进行集落形成和骨髓移植（BMT）实验，监测白血病发生和生存；用LDA评估干性；用二次BMT评估维持作用。
评估Igf2bp3缺失对正常造血的影响
确定靶向Igf2bp3的安全性。
比较Igf2bp3 KO小鼠与野生型小鼠的外周血细胞计数、骨髓造血干/祖细胞及成熟细胞比例；进行竞争性骨髓移植实验，评估HSC再增殖能力。
评估IGF2BP3抑制联合SG限制的协同抗白血病效果
验证靶向IGF2BP3联合SG剥夺在体外和体内的协同疗效。
在患者来源AML细胞和MA9白血病小鼠细胞中，检测IGF2BP3敲低联合SG剥夺对生长和集落形成的影响；在PDX和MA9 BMT模型中，给予SG缺乏饮食，监测生存；在U937 BP3-mAID异种移植模型中，用5’Ph-IAA诱导IGF2BP3降解并联合SG缺乏饮食。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | Invitrogen | -- | |
| 非必需氨基酸 | -- | -- | |
| 胰岛素 | Invitrogen | -- | |
| IMDM培养基 | -- | -- | |
| 干细胞因子 | -- | -- | |
| 血小板生成素 | -- | -- | |
| Flt-3配体 | -- | -- | |
| 白细胞介素-3 | -- | -- | |
| 白细胞介素-6 | -- | -- | |
| 丝氨酸/甘氨酸剥夺 | 无丝氨酸和甘氨酸的RPMI-1640 | BOSTER | DZPYG0062 |
| 药物处理 | NCT-503 | -- | -- |
| AID2降解 | 5-苯基-1H-吲哚-3-乙酸 | MedChem Express | HY-134653 |
| 流式分析 | FITC Annexin V凋亡检测试剂盒1 | BD Biosciences | -- |
| 抗小鼠CD16/32抗体 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Pacific-blue标记Annexin V | Biolegend | -- | |
| Brilliant Violet 650标记Ki67 | Biolegend | -- | |
| 集落形成实验 | 小鼠甲基纤维素培养基 | ReachBio | 1201 |
| 小鼠甲基纤维素培养基 | R&D | HSC006 | |
| MethoCult H4434 Classic培养基 | StemCell Technologies | -- | |
| 4-羟基他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | -- | |
| G418 | GIBCO BRL | -- | |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Western blot | IGF2BP3抗体 | Bethyl Laboratories | A303-426A |
| IGF2BP3抗体 | Proteintech | 14642-1-AP | |
| METTL14抗体 | Sigma-Aldrich | HPA038002 | |
| ATF4抗体 | Cell Signaling Technology | 11815S | |
| PHGDH抗体 | Proteintech | 14719-1-AP | |
| PSAT1抗体 | Proteintech | 10501-1-AP | |
| FLAG抗体 | Cell Signaling Technology | 14793S | |
| GAPDH抗体 | MBL International | M171-3 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| ECL蛋白质印迹底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| HiScript III RT Super-Mix for qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | -- | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Fisher | -- | |
| RIP | 抗IGF2BP3抗体 | -- | -- |
| MeRIP | m6A抗体 | Abcam | ab151230-100ug |
| BST-qPCR | Bst 3.0 DNA聚合酶 | New England Biolabs | -- |
| 代谢组学 | U-[13C6]葡萄糖 | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | -- |
| 正缬氨酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 丝氨酸检测 | DL-丝氨酸检测试剂盒 | Abcam | -- |
| 细胞培养 | Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Life Sciences | -- |
| 细胞分选 | CD34+磁珠 | Miltenyi Biotec | -- |
| 小鼠谱系细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| CD117磁珠 | Miltenyi Biotec | -- | |
| CRISPR筛选 | Quick-DNA Midiprep Plus试剂盒 | Zymo Research | -- |
| VAHTS HiFi聚合酶 | Vazyme | -- | |
| QIAquick凝胶回收试剂盒 | Qiagen | -- | |
| RNA-seq | NEBNext Ultra RNA文库构建试剂盒（Illumina） | NEB | -- |
| 质粒构建 | pLKO.1载体 | Addgene | -- |
| Px330 | Addgene | -- | |
| 病毒包装 | pCL-Eco包装载体 | IMGENEX | -- |
| pMD2.G | Addgene | -- | |
| pPAX2 | Addgene | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR/Cas9筛选 | 细胞模型（Molm13-Cas9）、sgRNA文库覆盖423个表观遗传基因、感染MOI<0.3、嘌呤霉素筛选5天、传代至8/12/17个群体倍增、测序平台及生物信息分析参数 阅读提示：Methods 'CRISPR/Cas9-based screening'及Figure 1C图注 |
| IGF2BP3/m6A调控SSP的分子验证 | RIP和MeRIP-qPCR所用抗体、引物序列（Table S2）、METTL14敲低效率、放线菌素D浓度（5 μg/ml）及处理时间点 阅读提示：Methods 'RNA immunoprecipitation (RIP)'、'Gene-specific m6A qPCR'、'RNA stability assays'及Figure 3图注 |
| 小鼠骨髓移植（BMT） | 供体细胞数量（0.1–0.2×10^6）、辅助细胞数量（1×10^6）、受体小鼠年龄（7–9周）、辐照剂量（致死5 Gy+5 Gy；亚致死4.5 Gy）、移植途径（尾静脉） 阅读提示：Methods 'Mouse bone marrow transplantation (BMT)'及Figure 4A、4P图注 |
| AID2诱导IGF2BP3降解 | 5’Ph-IAA浓度（体外1 μM；体内3 mg/kg）、处理时间（体外24小时或指定时间；体内连续7天）、给药途径（腹腔注射） 阅读提示：Methods 'Auxin-induced degradation'及Figure 1J、1K、7G图注 |
| 丝氨酸/甘氨酸限制饮食实验 | 饮食配方（无丝氨酸和甘氨酸，Trophic Animal Feed High-Tech定制）、开始饮食时间（移植后）、对照饮食组成 阅读提示：Methods 'Drug treatment of AML mouse model'及Figure 7C、7F、7H图注 |