Fis1 N端动态的分子动力学模拟
探究Fis1 N端尤其是α1螺旋的动态特性及磷酸化对其的影响。
对WT Fis1、pThr34和pY38 Fis1进行30个独立的1.2 μs MD模拟，计算RMSF、α螺旋倾向性和Cys41的SASA。
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靶向Fis1中隐藏的半胱氨酸以预防氧化应激下的过度线粒体分裂和功能障碍
A hidden cysteine in Fis1 targeted to prevent excessive mitochondrial fission and dysfunction under oxidative stress.
实验完整度
高包含MD模拟、X射线晶体学、SAXS、生化实验及多种细胞模型的功能验证，至少两个独立证据层级。
主要模型
HK-2细胞 Be(2)-M17细胞（野生型和Cys41Ser敲入） Fis1敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）转染WT或C41S Fis1
重点核对
HK-2细胞中H2O2（50或100 µM）与SP11（250 nM）共处理24小时，检测线粒体ROS和形态。 Be(2)-M17 Cys41Ser敲入细胞中H2O2（50 µM）和SP11（250 nM）共处理24小时，MitoSOX检测。 Fis1 KO MEF转染WT或C41S Fis1，H2O2（50 µM）处理6或24小时，SP11（250 nM）预处理30分钟。 CPM荧光 assay：4 µM Fis1蛋白，8 µM CPM，SP11浓度梯度，检测Cys41暴露。 重组Fis1蛋白（WT、Thr34Asp、Tyr38Glu等）的X射线晶体学和SEC-SAXS分析。
摘要
Fis1介导的Drp1线粒体定位和过度线粒体分裂发生在与氧化应激相关的人类病理中。然而，尚不清楚Fis1如何检测氧化应激以及Fis1中的哪些结构变化使得Drp1被招募到线粒体。我们发现，涉及Fis1中α1螺旋的构象变化暴露了其唯一的半胱氨酸Cys41。在氧化应激存在下，活化Fis1中暴露的Cys41形成二硫键，Fis1共价同源二聚体通过增加Drp1向线粒体的招募导致线粒体分裂增加。我们发现了一种小分子SP11，它通过结合Cys41仅与活化的Fis1结合，来自缺乏Cys41的基因工程细胞系的数据强烈提示Fis1同源二聚化在Drp1招募至线粒体和过度线粒体分裂中的作用。活化的Fis1-SP11复合物的结构进一步证实了这些关于Cys41作为氧化应激传感器的见解。重要的是，SP11在氧化应激期间保持细胞中的线粒体完整性和功能，因此可能作为开发治疗具有潜在Fis1介导的线粒体碎片化和功能障碍的疾病的候选分子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Fis1如何检测氧化应激并发生结构变化以招募Drp1到线粒体，以及能否用小分子抑制这一过程？
- 核心机制
- Fis1在氧化应激下通过Thr34或Tyr38磷酸化导致α1螺旋构象变化，暴露Cys41，形成二硫键介导的共价同源二聚体，从而增加Drp1线粒体招募和过度线粒体分裂；SP11共价结合活化Fis1的Cys41并抑制该过程。
- 主要证据
- MD模拟显示α1螺旋动态和Cys41暴露增加；X射线晶体学显示磷酸化模拟突变体缺失α1螺旋并形成Cys41二硫键二聚体；CPM荧光 assay显示突变体Cys41暴露增加；细胞实验显示SP11抑制H2O2诱导的线粒体ROS、碎片化和Drp1转位，且Cys41Ser突变细胞对SP11无响应。
- 研究意义
- SP11作为首个靶向活化Fis1的共价抑制剂，可能成为治疗Fis1介导的线粒体碎片化和功能障碍相关疾病的候选分子。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Fis1及其磷酸化模拟突变体的X射线晶体学
确定活化Fis1的结构变化，验证α1螺旋的构象改变和Cys41介导的二聚化。
结晶WT Fis1、Thr34Asp、Thr34Glu、Tyr38Glu Fis1及Thr34Asp-SP11复合物，收集衍射数据并解析结构。
溶液小角X射线散射（SEC-SAXS）分析
在溶液中验证Fis1突变体的结构变化和二聚体状态。
使用SEC-SAXS分析WT、Thr34Asp和Tyr38Glu Fis1，计算Porod体积和Kratky图，建模WT二聚体结构。
Cys41暴露的生化检测（CPM荧光 assay）
验证磷酸化模拟突变体中Cys41的暴露程度。
使用硫醇反应性马来酰亚胺荧光探针CPM检测WT、Thr34Asp、Tyr38Glu和Cys41Ser Fis1的Cys41反应性。
Fis1共价二聚化的生化验证
验证Cys41介导的Fis1共价二聚化及其在活化突变体中的增强。
将Fis1胞质结构域固定于His标签磁珠，在非还原非加热变性条件下进行SDS-PAGE，检测二聚体形成。
小分子SP11的筛选与鉴定
发现能特异性结合活化Fis1 Cys41的小分子抑制剂。
使用CPM荧光 assay筛选6000个含硫醇反应性共价弹头的分子，以Thr34Asp Fis1为靶标，Cys41Ser Val56Cys双突变体为反筛，鉴定出SP11。
SP11与活化Fis1的共结晶及结合验证
确定SP11与Fis1的结合模式及关键相互作用。
解析Thr34Asp Fis1-SP11复合物晶体结构（1.9 Å），并通过MS/MS肽图验证SP11修饰Cys41，以及突变Tyr38Glu验证结合特异性。
SP11在细胞中抑制氧化应激诱导的线粒体分裂和功能障碍
验证SP11对Fis1介导的线粒体ROS产生、碎片化和Drp1转位的影响。
在HK-2、Be(2)-M17（WT和Cys41Ser）及Fis1 KO MEF（转染WT或C41S Fis1）中，用H2O2诱导氧化应激，SP11处理，检测线粒体ROS（MitoSOX）、形态（MitoTracker）和Drp1线粒体定位（免疫印迹）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
蛋白质生化与修饰检测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CPM荧光检测 | CPM探针 | Abcam | ab145275 |
| 小分子合成与筛选 | SP11 | Enamine | -- |
| SP22 | Enamine | -- | |
| 重组蛋白表达 | 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | GoldBio | -- |
| 重组蛋白纯化 | 镍-次氮基三乙酸琼脂糖 | Qiagen | -- |
| Zeba旋转脱盐柱 | Thermo Fisher Scientific | 89894 | |
| Fis1固定化实验 | HisPur镍-次氮基三乙酸磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Cytiva | SH30023.01 |
| 胎牛血清 | GeminiBio | 100-500-500 | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 人表皮生长因子 | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| MEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 10370-201 | |
| Ham's F-12营养混合物 | Thermo Fisher Scientific | 31756035 | |
| 基因编辑验证 | Quick-DNA微量制备试剂盒 | Zymo Research | D4074 |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX红色线粒体超氧化物指示剂 | Thermo Fisher Scientific | M36008 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A18967-01 | |
| 活细胞成像 | MitoTracker深红色FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 |
| 玻璃底培养皿 | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| 无葡萄糖、半乳糖补充的DMEM/F12培养基 | Thermo Fisher Scientific | A2494301 | |
| 线粒体分离 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11697498001 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 免疫印迹 | Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX预制蛋白凝胶 | Bio-Rad | -- | |
| 增强化学发光试剂 | Thermo Fisher Scientific | PI34095 | |
| 抗Drp1抗体 | Cell Signaling Technology | #8570 | |
| 抗VDAC抗体 | Abcam | ab15895 | |
| 抗α/β微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | #2148 | |
| 抗Fis1抗体 | Proteintech | 10956-1-AP | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | #3700 | |
| 抗兔IgG | Cytiva | NA934V | |
| 抗鼠IgG | Cytiva | NA931V | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 |
| Opti-MEM减血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| 细胞培养 | 过氧化氢 | Sigma-Aldrich | H1009 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞类型（HK-2、Be(2)-M17、Fis1 KO MEF）、传代次数、培养基配方（如DMEM/F12含10% FBS、1% P/S、5 ng/ml hEGF）、H2O2浓度（50或100 µM）、SP11浓度（250 nM）、处理时间（24小时或6小时）。 阅读提示：Methods部分'Cell cultures'和'Measurement of mitochondrial reactive oxygen species'及'Live-cell imaging for mitochondrial morphology'小节。 |
| CPM荧光 assay | 蛋白浓度（4 µM）、CPM浓度（8 µM）、缓冲液（PBS）、孵育时间（30分钟）、荧光检测波长（Ex 391 nm / Em 472 nm）、SP11浓度梯度。 阅读提示：Methods部分'CPM fluorescence assay'小节。 |
| Fis1固定化与二聚化检测 | 蛋白量（20 µg）、磁珠体积（20 µL）、缓冲液成分（50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 10 mM 2-ME, 0.1% Tween-20）、孵育时间、SDS-PAGE条件（非还原非加热变性）。 阅读提示：Methods部分'Fis1 immobilization experiment'小节。 |
| X射线晶体学 | 蛋白浓度（8 mg/ml）、结晶条件（如WT: 25% PEG 5KMMe, 0.15 M NaCl等）、冷冻保护剂（甘油浓度）、衍射数据收集参数（温度100 K，光束线BL12-2）。 阅读提示：Methods部分'Crystallization, data collection and structure determination'小节及Supplementary Table 4。 |
| SEC-SAXS | 蛋白浓度（5-6 mg/ml）、色谱柱（Superdex 75 Increase 3.2/300）、流速（0.05 ml/min）、曝光时间（1 s）、采集图像数（500）、缓冲液（50 mM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl）。 阅读提示：Methods部分'SEC-SAXS experiments and analyses'小节及Supplementary Table 2。 |
| MD模拟 | 模拟时长（1.2 µs）、独立重复数（30）、力场（Amber ff14SB和phosaa14SB）、水模型（TIP3P）、离子浓度（150 mM NaCl）、温度（298.15 K）、压力（1 bar）。 阅读提示：Methods部分'Molecular dynamics (MD) simulations'小节及Supplementary Table 3。 |