dCas9-TurboID系统在卫星区的验证
验证dCas9-TurboID系统能否在特定基因组区域进行邻近标记。
将dCas9与全长TurboID及GFP融合（dCas9-GFP-FLTurb），利用靶向α-卫星的sgAS或对照sgGal4，在HeLa细胞中进行生物素标记，并通过western blot、免疫荧光和质谱验证富集蛋白。
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SelectID选择性鉴定甲基化基因组位点的表观遗传调控因子
Selective identification of epigenetic regulators at methylated genomic sites by SelectID.
实验完整度
高包含CRISPR成像、蛋白质组学、ChIP-seq、RNA-seq、RNA-FISH、Bisulfite测序等多层级功能与机制验证。
主要模型
HeLa细胞系 HEK293T细胞系 dCas9-GFP14x HeLa细胞系 稳定表达SelectID元件的HeLa细胞系
重点核对
dCas9-GFP-NTurb与MBD-BFP-CTurb在sgChr9S靶向的9号染色体卫星区的共定位及链霉亲和素信号 MBD R44Q突变体或5-Aza-dC处理导致共定位链霉亲和素斑点消失 micro-DIA质谱鉴定9号染色体卫星区及L1 5'UTR相关蛋白，并以MBDmut排除背景 CHD4敲低后RNA-seq和RNA-FISH检测年轻L1元件表达上调 ChIP-seq验证CHD4结合L1 5'UTR甲基化区域及MBD富集
摘要
DNA甲基化是近端染色质调控的重要组成部分，在调节基因表达和维持逆转录转座子元件的抑制状态中发挥关键作用。然而，同时鉴定特定DNA序列及其相关表观遗传修饰的蛋白质组学精准分析方法仍面临挑战。在此，我们报道了一种称为SelectID（通过dCas9鉴定的基因组靶标表观遗传调控选择性分析）的策略，该策略将甲基化DNA结合结构域引入dCas9介导的邻近标记系统，从而能够在具有5-甲基胞嘧啶（5mC）修饰的重复元件处进行原位蛋白质捕获。SelectID被证明在特定DNA甲基化区域（如9号染色体卫星区）与dCas9-TurboID系统一样可行。利用SelectID，我们通过直接结合年轻LINE-1元件的5'非翻译区（5'UTR），成功鉴定出CHD4是甲基化长散在核元件-1（LINE-1）逆转录转座子的潜在抑制因子。总体而言，我们的SelectID方法为发现具有DNA甲基化的特定DNA区域的潜在调控因子开辟了途径，将极大促进未来的表观遗传调控研究。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何同时识别特定DNA序列及其DNA甲基化修饰状态，并鉴定与之相关的表观遗传调控蛋白？
- 核心机制
- SelectID通过dCas9靶向特定基因组位点，并利用MBD结构域结合5mC，通过split-TurboID在邻近区域进行生物素化标记，从而捕获甲基化DNA区域相关蛋白；CHD4通过直接结合年轻L1元件5'UTR的甲基化区域抑制其表达。
- 主要证据
- 在9号染色体卫星区和L1 5'UTR，CRISPR成像显示链霉亲和素信号与dCas9共定位，且MBDmut或5-Aza-dC处理使信号消失；micro-DIA质谱鉴定相关蛋白；CHD4敲低导致L1表达上调，ChIP-seq显示CHD4结合甲基化5'UTR。
- 研究意义
- SelectID为研究特定DNA区域DNA甲基化相关调控因子提供了有力且通用的工具，有助于在等位基因特异性水平深入探究蛋白质组学。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SelectID系统的构建与split-TurboID切割位点比较
构建基于split-TurboID的SelectID系统，并选择最佳切割位点。
构建dCas9-GFP-NTurb和MBD-BFP-CTurb（或MBDmut-BFP-CTurb）融合蛋白，比较L73/G74和E256/G257两个split-TurboID切割位点，通过western blot和共聚焦成像评估催化活性。
SelectID在9号染色体卫星区的CRISPR成像验证
验证SelectID能否在具有DNA甲基化的9号染色体卫星区进行特异性生物素化标记。
在HeLa细胞中转染SelectID系统组分和sgChr9S或sgGal4，进行生物素标记和链霉亲和素染色，通过共聚焦成像分析链霉亲和素斑点与dCas9-GFP的共定位；并用MBDmut或5-Aza-dC处理验证甲基化依赖性。
SelectID结合micro-DIA质谱鉴定9号染色体卫星区相关蛋白
利用SelectID和micro-DIA质谱鉴定9号染色体卫星区甲基化DNA相关蛋白。
建立稳定表达SelectID或FL-system的HeLa细胞系，经多西环素诱导和生物素标记后，链霉亲和素富集蛋白，进行micro-DIA质谱分析，并以MBDmut组排除背景。
SelectID鉴定甲基化L1 5'UTR相关蛋白
利用SelectID鉴定与甲基化年轻L1元件5'UTR相关的调控蛋白。
设计靶向L1 5'UTR的sgL1-1和sgL1-2，在HeLa细胞中进行SelectID和micro-DIA质谱，鉴定富集蛋白，并通过ChIP-seq验证dCas9-NTurb和MBD-CTurb的结合。
CHD4对L1表达的调控验证
验证CHD4是否结合甲基化L1 5'UTR并抑制L1表达。
在HeLa细胞中敲低CHD4，通过RNA-seq和RNA-FISH检测年轻L1元件表达；通过生物素亲和免疫沉淀验证CHD4被sgL1s富集；通过ChIP-seq检测CHD4结合L1 5'UTR；通过亚硫酸氢盐测序检测CHD4敲低对L1 5'UTR甲基化水平的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | BI | -- |
| 胎牛血清 | BI | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Hyclone | -- | |
| siRNA转染 | Hieff Trans转染试剂 | Yeason | -- |
| opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| 慢病毒包装 | 聚乙烯亚胺 | -- | -- |
| 诱导表达 | 多西环素 | -- | -- |
| 生物素标记 | 生物素 | Sangon biotech | -- |
| 免疫染色 | Alexa Fluor™ 647标记链霉亲和素 | Thermofisher | S911 |
| 抗PLK1抗体 | Proteintech | 10305-1-AP | |
| 抗BAZ1B抗体 | abcam | ab51256 | |
| 抗PIMREG抗体 | ABclonal | A16222 | |
| 抗NOSIP抗体 | Proteintech | 27979-1-AP | |
| 抗CBX3抗体 | Proteintech | 11650-2-AP | |
| RNA原位杂交 | PinpoRNATM RNA原位杂交试剂盒 | GD Pinpoease Biotech Co. Ltd. | PIT1000 |
| OpalTM520荧光染料 | Akoya Biosciences | -- | |
| 链霉亲和素亲和纯化 | 链霉亲和素磁珠 | Invitrogen | -- |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| ImageQuant LAS 4000成像系统 | GE | -- | |
| micro-DIA质谱 | 测序级胰蛋白酶 | Promega | -- |
| C18色谱柱 | Thermo Scientific | -- | |
| Vanquish™ Neo超高效液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- | |
| Orbitrap Exploris™ 480质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| RNA提取 | RNAiso plus试剂 | TAKARA | -- |
| RT-qPCR | HiScript II Q RT Supermix for qPCR | Vazyme | -- |
| CFX384实时定量PCR系统 | Bio-RAD | -- | |
| 亚硫酸氢盐测序 | FastPure细胞/组织DNA分离迷你试剂盒 | Vazyme | -- |
| EpiArt DNA甲基化亚硫酸氢盐试剂盒 | Vazyme | -- | |
| 2×EpiArt HS Taq预混液 | Vazyme | -- | |
| pGEM-T Easy克隆载体 | Promega | -- | |
| ChIP-seq | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Beyotime | P2078 |
| VAHTS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina V4 | Vazyme | ND610 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SelectID系统构建与诱导表达 | dCas9-GFP-NTurb和MBD-BFP-CTurb的融合方式、split-TurboID切割位点L73/G74、多西环素诱导浓度0.5 μg/mL及处理时间12小时；MBDmut对照（R44Q突变） 阅读提示：Methods中“Plasmids construction and generation of stable cell lines”及Results中“Development of proximity labeling using dCas9-mediated split-TurboID system” |
| 生物素标记与CRISPR成像 | 生物素浓度50 μM，FL-system处理0.5小时，Sp-system处理1小时；固定和链霉亲和素染色条件；sgChr9S和sgGal4序列 阅读提示：Methods中“Immunostaining and CRISPR Imaging”及图2图注 |
| micro-DIA质谱样品制备 | 每组细胞量5×10^6，生物学重复3次；胰蛋白酶酶切比例1:20；DIA质谱参数（Orbitrap Exploris 480，隔离窗口5 m/z，质量范围400-1000 m/z等） 阅读提示：Methods中“Micro-DIA mass spectrometry and data processing”及图3图注 |
| CHD4功能验证 | shCHD4和siRNA敲低效率；RNA-seq和RNA-FISH检测时间点；ChIP-seq中CHD4抗体用量1 μg；亚硫酸氢盐测序每组克隆数至少10个 阅读提示：Methods中“RNA extraction and RT-qPCR”、“Bisulfite PCR sequencing”、“ChIP-seq and data processing”及图6图注 |