远红GECI的蛋白质工程
获得基于mKelly2的远红荧光Ca2+指示剂
将K-GECO1的cpFusionRed替换为cpmKelly2，优化linker1，并进行八轮定向进化，获得FR-GECO1a；进一步引入mKelly1特异性突变组合，筛选获得FR-GECO1c。
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远红荧光基因编码钙离子指示剂
Far-red fluorescent genetically encoded calcium ion indicators.
实验完整度
高包含体外纯化蛋白表征、HeLa细胞和原代神经元成像、斑马鱼胚胎在体成像及光遗传学联用验证，跨多个独立证据层级并有功能验证
主要模型
大肠杆菌表达纯化蛋白 HeLa细胞 原代大鼠海马和皮层神经元 斑马鱼胚胎心脏
重点核对
FR-GECO1a和FR-GECO1c的Kd分别为29 nM和83 nM，nH分别为1.49和1.98 FR-GECO1a和FR-GECO1c的Ca2+依赖性ΔF/F0在体外分别为6和18，在神经元中3 APs响应分别为27%和28% 斑马鱼胚胎心脏中FR-GECO1a和FR-GECO1c的ΔF/F0分别为11%和30%，显著高于NIR-GECO2和NIR-GECO2G的3% FR-GECO1c在594 nm激发下与CheRiff联用，470 nm蓝光刺激诱导的ΔF/F0在0.07 mW/mm2和0.35 mW/mm2下分别为60%和280% 双光子激发峰值在1112 nm，FR-GECO1a和FR-GECO1c的2P分子亮度分别为9.2 GM和7.4 GM
摘要
基因编码钙离子（Ca2+）指示剂（GECIs）是广泛使用的分子工具，用于以单细胞分辨率对Ca2+动态和神经元活动进行功能成像。在此，我们报告了基于单体远红荧光蛋白mKelly1和mKelly2的两种远红荧光GECIs——FR-GECO1a和FR-GECO1c的设计与开发。FR-GECOs的激发和发射最大值分别约为596 nm和644 nm，在体外对Ca2+表现出大响应（FR-GECO1a的ΔF/F0=6，FR-GECO1c为18），在单光子和双光子照明下均明亮，并且对Ca2+具有高亲和力（FR-GECO1a的表观Kd=29 nM，FR-GECO1c为83 nM）。FR-GECOs能够灵敏且快速地检测神经元中的单个动作电位，并与光遗传学执行器结合，实现体内全光学操作和细胞活动测量。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否基于远红荧光蛋白mKelly1和mKelly2开发出兼具远红激发发射波长和高亮度的基因编码钙离子指示剂，并用于神经元活动和在体全光学成像？
- 核心机制
- 将K-GECO1的cpFusionRed替换为cpmKelly2，并通过定向进化优化连接肽和引入突变，获得FR-GECO1a和FR-GECO1c；其远红光谱和Ca2+依赖性荧光变化源于cpFP与CaM/ckkap结构域的相互作用。
- 主要证据
- 体外纯化蛋白光谱和Ca2+滴定显示FR-GECO1a/1c具有远红激发发射（~596/642-646 nm）、大ΔF/F0（6/18）和高亲和力（Kd 29/83 nM）；原代神经元成像显示其可检测单个动作电位；斑马鱼胚胎心脏在体成像显示其ΔF/F0和SNR优于NIR-GECOs；与CheRiff/CoChR联用实现全光学起搏和Ca2+成像。
- 研究意义
- FR-GECO1a和FR-GECO1c扩展了基于非胆绿素结合FP的GECI光谱 palette，为多色Ca2+成像和与蓝光激活光遗传学工具联用的在体全光学研究提供了新工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
纯化蛋白的光物理表征
测定FR-GECO1a和FR-GECO1c的光谱、亮度、Ca2+亲和力、pH敏感性和动力学
在大肠杆菌中表达并纯化蛋白，测定吸收/激发/发射光谱、EC、QY、Kd、Hill系数、pKa、kon/koff以及双光子光谱和亮度。
培养细胞中的功能验证
验证FR-GECO1a和FR-GECO1c在HeLa细胞和原代神经元中报告Ca2+变化的能力
在HeLa细胞中观察组胺诱导的Ca2+振荡和EGTA/ionomycin、Ca2+/ionomycin处理后的ΔF/F0；在原代大鼠海马和皮层神经元中通过电刺激诱导动作电位，比较FR-GECO1a/1c与jRGECO1a/jRCaMP1a的荧光响应、上升/衰减时间和SNR。
斑马鱼胚胎心脏在体成像及与NIR-GECOs比较
评估FR-GECO1在体报告心脏Ca2+动态的性能并与近红外GECIs比较
在斑马鱼胚胎心脏中表达FR-GECO1a、FR-GECO1c、NIR-GECO2、NIR-GECO2G或iGECI，测量自发心跳的ΔF/F0、平均强度和SNR。
全光学心脏起搏和Ca2+成像
验证FR-GECO1与蓝光激活通道视紫红质联用实现全光学操作和测量的可行性
在培养神经元和斑马鱼胚胎心脏中共表达FR-GECO1与CheRiff或CoChR，用594 nm光成像FR-GECO1，用488 nm或470 nm光刺激通道视紫红质，记录Ca2+瞬变。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 分子克隆 | CloneAmp HiFi PCR预混液 | Takara Bio USA, Inc. | 639298 |
| Q5聚合酶 | New England Biolabs | M0491L | |
| Taq聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | EP0406 | |
| GeneJET凝胶回收试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K0692 | |
| T4 DNA连接酶 | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| In-Fusion HD克隆试剂盒 | Takara Bio USA, Inc. | 639650 | |
| GeneJET质粒小提试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K0503 | |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA树脂 | G Biosciences | 786-408 |
| 10 kDa离心过滤单元 | Millipore Sigma | UFC801024, UFC901024 | |
| 光谱测量 | Safire2酶标仪 | Tecan | -- |
| DU-800紫外可见分光光度计 | Beckman | -- | |
| 双光子表征 | InSight DeepSee双光子激光器 | Spectra Physics | -- |
| PC1荧光分光光度计 | ISS | -- | |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Nakalai Tesque | 08456-65 |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| 青霉素-链霉素 | Nakalai Tesque | 09367-34 | |
| 细胞转染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 24765-1 |
| 细胞成像 | IX83宽场荧光显微镜 | Olympus | -- |
| pE-300 LED光源 | CoolLED | -- | |
| ImagEM X2 EM-CCD相机 | Hamamatsu | -- | |
| 神经元培养 | 木瓜蛋白酶 | Worthington | LS003126 |
| 神经基础培养基 | Gibco | 21103049 | |
| B-27添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| GlutaMax添加剂 | Gibco | 35050-061 | |
| 阿糖胞苷 | Sigma Aldrich | C-1768 | |
| 神经元成像 | Zeiss Observer Z.1显微镜 | Zeiss | -- |
| Axiocam 503 m相机 | Zeiss | -- | |
| 全光学电生理 | Cobolt Mambo 594 nm激光器 | Hubner Photonics | -- |
| Coherent Obis 488 nm激光器 | Coherent | 1226419 | |
| 斑马鱼在体成像 | Olympus XLPLN25XWMP2物镜 | Olympus | -- |
| Hamamatsu Orca Flash sCMOS相机 | Hamamatsu | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| FR-GECO1蛋白质工程 | 初始模板K-GECO1、cpmKelly2替换、linker1优化、八轮定向进化及筛选标准（荧光强度和Ca2+依赖性ΔF/F0） 阅读提示：Methods中Protein engineering小节及Supplementary Table 1-2 |
| 纯化蛋白Ca2+亲和力测定 | 游离Ca2+浓度范围（0至39 μM）、缓冲液组成（30 mM MOPS, 100 mM KCl, 10 mM EGTA/Ca-EGTA, pH 7.2）、三次技术重复 阅读提示：Methods中Brightness, affinity, and pH-sensitivity measurement小节及Fig. 1G,H |
| 原代神经元动作电位成像 | 神经元来源（新生大鼠海马和皮层）、电刺激强度（3、10、160 APs）、成像帧率（206 Hz）、 synaptic blockers组成 阅读提示：Methods中Imaging of cultured neurons with electrical stimulation小节及Fig. 2 |
| 斑马鱼胚胎心脏GECI比较 | 胚胎注射mRNA量（20 fmol）、成像时间（24-30 hpf）、激发光波长和强度（594 nm, 23 mW/mm2）、SNR计算方法和排除标准（SNR<5） 阅读提示：Methods中GECI comparisons in embryonic zebrafish小节及Fig. 3 |
| 全光学心脏起搏 | FR-GECO和CheRiff/CoChR的mRNA注射量、光刺激参数（488 nm, 24 mW/mm2, 1 Hz；脉冲宽度25 ms或75 ms）、成像帧率（33 Hz） 阅读提示：Methods中All-optical electrophysiology of embryonic zebrafish小节及Fig. 4G,H |