运动诱导脂肪KLF10表达的体内验证
验证运动是否特异性上调脂肪组织尤其是成熟脂肪细胞中KLF10表达
对CD喂养的8周龄雄性C57BL/6J小鼠进行8周跑步机训练，分离iWAT、eWAT和BAT的SVF与成熟脂肪细胞，检测Klf10 mRNA和蛋白表达
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
雄性小鼠中由FOXO1-KLF10正反馈环路促进脂肪分解产生的运动抗肥胖效应
Exercise-induced anti-obesity effects in male mice generated by a FOXO1-KLF10 reinforcing loop promoting adipose lipolysis.
实验完整度
高包含脂肪细胞特异性敲除和转基因小鼠、高脂饮食模型、原代脂肪细胞、AAV回补、ChIP、Co-IP、荧光素酶报告基因等多层次功能与机制验证
主要模型
雄性C57BL/6J小鼠高脂饮食诱导肥胖模型 脂肪细胞特异性KLF10敲除（KLF10AKO）雄性小鼠 脂肪细胞特异性KLF10转基因（KLF10ATG）雄性小鼠 原代脂肪细胞（SVF来源）及3T3-L1、C3H10T1/2脂肪细胞
重点核对
KLF10AKO小鼠与WT对照在HFD喂养12周、最后10周进行跑步机训练或久坐的分组 KLF10ATG小鼠与WT对照在HFD喂养12周、最后10周进行跑步机训练或久坐的分组 AAV-ATGL/AAV-HSL在iWAT和eWAT局部过表达以回补KLF10AKO表型 CL316,243刺激（体外2 μM，体内1 mg/kg体重）后血清FFA和甘油释放检测 ChIP和Re-ChIP检测FOXO1、KLF10、KDM4A在Pnpla2和Lipe启动子的结合及H3K9me3修饰
摘要
运动可对抗肥胖和代谢紊乱，但其潜在机制尚不完全清楚。KLF10是一种参与多种生物学过程的转录因子，其在脂肪组织和肥胖中的作用尚未明确。在此，我们展示运动通过SIRT1/FOXO1通路促进脂肪细胞来源的KLF10表达。脂肪细胞特异性敲除KLF10可减弱运动对饮食诱导肥胖雄性小鼠的白色脂肪棕色化、能量消耗、脂肪减少和葡萄糖耐量的促进作用。相反，雄性小鼠脂肪细胞特异性转基因表达KLF10可增强运动诱导的上述代谢益处。机制上，KLF10与FOXO1相互作用并促进KDM4A的招募，在Pnpla2和Lipe基因启动子区域形成三元复合物，通过去甲基化其启动子上的H3K9me3来促进这些关键脂解基因的表达，从而促进脂解以防御雄性小鼠肥胖。作为响应运动的下游效应因子，脂肪KLF10可作为对抗肥胖的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 运动如何通过脂肪组织中的KLF10调控脂解，从而改善肥胖和代谢紊乱？
- 核心机制
- 运动通过SIRT1/FOXO1通路诱导成熟脂肪细胞中KLF10表达；KLF10与FOXO1相互作用并招募KDM4A形成三元复合物，在Pnpla2和Lipe启动子上去甲基化H3K9me3，促进ATGL和HSL转录，增强脂解；脂解产物FFA作为PPARα配体激活PPARα，上调FAO和棕色化基因。
- 主要证据
- 在HFD喂养的雄性小鼠中，脂肪细胞特异性KLF10敲除减弱运动诱导的白色脂肪棕色化、能量消耗、脂肪减少和葡萄糖耐量改善；KLF10转基因表达与运动协同改善上述代谢指标；AAV介导ATGL和HSL回补可逆转KLF10AKO表型；ChIP、Re-ChIP、Co-IP和荧光素酶实验证实KLF10-FOXO1-KDM4A复合物及启动子结合。
- 研究意义
- 脂肪KLF10可作为响应运动的下游效应因子，为肥胖及代谢紊乱的预防和治疗提供潜在靶点；脂肪细胞特异性过表达KLF10与运动协同改善代谢，可能为肥胖患者更好地从运动训练中获益提供策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SIRT1/FOXO1调控KLF10转录的机制验证
验证FOXO1是否直接结合Klf10启动子并受SIRT1去乙酰化调控
荧光素酶报告基因、ChIP、FOXO1乙酰化检测、SIRT1活性检测，以及在3T3-L1脂肪细胞中使用Ex527和Srt1720处理及FOXO1敲低
KLF10AKO对运动诱导棕色化和脂解的影响
验证脂肪细胞KLF10敲除是否减弱运动诱导的脂肪棕色化和脂解
KLF10AKO与WT雄性小鼠进行8周跑步机训练或久坐，检测脂肪细胞大小、UCP1表达、棕色化基因和FAO基因表达、冷暴露下血清FFA和甘油、ATGL和HSL表达
KLF10AKO对HFD诱导肥胖和代谢紊乱的影响
验证脂肪细胞KLF10敲除是否减弱运动抗DIO和改善代谢的作用
WT和KLF10AKO雄性小鼠HFD喂养12周，最后10周跑步机训练或久坐，检测体重、体成分、脂肪重量、冷耐受、GTT、ITT、HOMA-IR、能量代谢和iWAT OCR
KLF10调控脂解的细胞和分子机制
验证KLF10是否通过促进ATGL和HSL表达增强脂解，并依赖PPARα上调棕色化和FAO基因
RNA-seq分析KLF10AKO iWAT差异基因；原代脂肪细胞AD-Cre敲除或AD-KLF10过表达，检测FFA和甘油释放、ATGL/HSL表达；ISO刺激；PPARα拮抗剂GW6471处理；ATGL和HSL敲低
ATGL/HSL回补对KLF10AKO表型的挽救
验证脂解受损是否为KLF10AKO加重DIO和代谢紊乱的关键原因
向WT和KLF10AKO雄性小鼠iWAT和eWAT注射AAV-ATGL、AAV-HSL或AAV-GFP，1周后HFD喂养12周，检测冷耐受、体重、脂肪重量、脂解能力、葡萄糖耐量和胰岛素敏感性
KLF10-FOXO1-KDM4A复合物的转录调控机制
验证KLF10是否作为FOXO1共因子招募KDM4A，去甲基化H3K9me3以激活Pnpla2和Lipe转录
荧光素酶报告基因、ChIP、Re-ChIP、Co-IP、组蛋白甲基化修饰检测、KDM4A敲低、FOXO1敲低
KLF10ATG对运动改善DIO和代谢的协同作用
验证脂肪细胞特异性过表达KLF10是否与运动协同改善HFD诱导的肥胖和代谢紊乱
KLF10ATG与WT雄性小鼠HFD喂养12周，最后10周跑步机训练或久坐，检测体重、体成分、冷耐受、GTT、HOMA-IR、能量代谢、脂解能力和产热基因表达
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 高脂饮食（60 kcal%脂肪，PD6001） | SYSE BIO | PD6001 |
| 普通饮食（1010086） | Xietong Shengwu | 1010086 | |
| 跑步机训练 | 跑步机（ZH-PT/5S） | ZhengHuabiological | ZH-PT/5S |
| 脂解实验 | CL316,243 | MCE | -- |
| 甘油含量测定试剂盒（E1002） | Applygen | E1002 | |
| 游离脂肪酸检测试剂盒（Ek-M21104） | EK-bioscience | Ek-M21104 | |
| 肝脏TG测定 | 甘油三酯测定试剂盒（#E1003） | Applygen | E1003 |
| SIRT活性测定 | SIRT1活性测定试剂盒（ab156065） | Abcam | ab156065 |
| SIRT6测定试剂盒（50022） | BPSbioscience | 50022 | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | -- | |
| 小牛血清 | Gibco | -- | |
| 脂肪组织消化 | I型胶原酶（9001-12-1） | Solarbio | 9001-12-1 |
| RNA干扰 | RNAiMAX转染试剂（#13778-100） | Invitrogen | 13778-100 |
| 荧光素酶实验 | Lipo6000转染试剂（#C0526） | Beyotime | C0526 |
| 双荧光素酶报告基因试剂盒（#RG027） | Beyotime | RG027 | |
| ChIP | ChIP级Protein A/G磁珠（26162） | Thermo Fisher | 26162 |
| 抗KLF10抗体（sc-130408） | Santa Cruz | sc-130408 | |
| 抗FOXO1抗体（2880s） | CST | 2880s | |
| 抗H3K9me3抗体（A22295） | Abclonal | A22295 | |
| 抗KDM4A抗体（A22060） | Abclonal | A22060 | |
| Western blot | 抗ATGL抗体（2138s） | CST | 2138s |
| 抗HSL抗体（17333-1-AP） | Proteintech | 17333-1-AP | |
| 抗β-tubulin抗体（M20005F） | Abmart | M20005F | |
| 抗KLF10抗体（A2433） | Abclonal | A2433 | |
| 抗FOXO1抗体（sc-374427） | Santa Cruz | sc-374427 | |
| 免疫组化 | 抗UCP1抗体（A5857） | Abclonal | A5857 |
| 血糖测定 | 血糖仪 | Roche | -- |
| 代谢笼 | 间接测热系统（TSE-system, XYZ, 6M/R） | Germany Instruments | 6M/R |
| 氧消耗率测定 | Oxygraph-2k高分辨率呼吸测定仪 | Oroboros | -- |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Takara | -- |
| Power SYBR green PCR预混液 | Beyotime | -- | |
| Quant Studio 6 Flex实时PCR仪 | Thermo Fisher | -- | |
| AAV注射 | AAV-ATGL、AAV-HSL、AAV-GFP | Genechem | -- |
| 腺病毒过表达/敲除 | Vira Power腺病毒表达系统 | Invitrogen | -- |
| Western blot | SDS-PAGE凝胶（abs9367） | Absin | abs9367 |
| Tanon-5200S成像系统 | BIO-RAD | -- | |
| 免疫共沉淀 | RIPA裂解液（P0013B） | Beyotime | P0013B |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 运动训练方案 | 8周龄雄性小鼠，跑步机训练8或10周、每周6天、60%最大跑速、ZT10-ZT11训练；训练速度每2周根据最大跑速调整 阅读提示：Methods中Treadmill training and time to exhaustion小节及Fig. 3a图注 |
| 高脂饮食诱导肥胖模型 | HFD 60 kcal%脂肪（PD6001, SYSE BIO）喂养12周；KLF10AKO和KLF10ATG实验均在HFD最后10周进行运动干预 阅读提示：Methods中Animals小节及Supplementary Fig. 4a、Supplementary Fig. 8b |
| 脂肪细胞特异性KLF10敲除和转基因小鼠构建 | KLF10flox/flox与Adiponectin-Cre杂交获得KLF10AKO；CMV-Stop-KLF10与Adiponectin-Cre杂交获得KLF10ATG；对照为同窝KLF10flox/flox/Adiponectin-Cre-或WT 阅读提示：Methods中Animals小节及Supplementary Fig. 3a-c、Supplementary Fig. 8a |
| AAV介导ATGL/HSL回补 | iWAT和eWAT每侧脂肪垫注射50 μl，总病毒滴度1×10^11 vg（AAV-GFP 1×10^11 vg；AAV-ATGL 0.5×10^11 vg；AAV-HSL 0.5×10^11 vg）；注射1周后HFD喂养12周 阅读提示：Methods中Application of adeno-associated viral (AAV) vectors小节及Fig. 6图注 |
| 脂解能力检测 | 体外：iWAT/eWAT组织60-80 mg在含2% BSA的DMEM中±CL316,243（2 μM）37°C 2 h；细胞：±ISO（2 μM）37°C 2 h；体内：CL316,243 i.p. 1 mg/kg体重，注射后0、20、60 min采血 阅读提示：Methods中Lipolysis assay小节及Fig. 5、Fig. 6、Fig. 8图注 |
| 葡萄糖耐量和胰岛素耐量实验 | GTT：禁食6 h后i.p.注射D-葡萄糖1.5 mg/g体重；ITT：禁食6 h后i.p.注射人胰岛素0.8 mIU/g体重；均在ZT10进行 阅读提示：Methods中Analyses of biochemistry-related parameters小节 |
| 冷耐受实验 | 禁食10 h后置于4°C环境，禁食状态维持5 h，直肠温度测量 阅读提示：Methods中Analyses of biochemistry-related parameters小节及Fig. 4g、Fig. 6a、Fig. 8i图注 |
| ChIP和Re-ChIP检测 | 交联条件：1%甲醛室温10 min，甘氨酸125 mM终止；抗体包括anti-KLF10（sc-130408）、anti-FOXO1（2880s）、anti-H3K9me3（A22295）、anti-KDM4A（A22060）等；n=6独立生物学重复 阅读提示：Methods中Chromatin immunoprecipitation (ChIP) and Re-ChIP小节及Supplementary information中引物列表 |
| RNA-seq分析 | HFD喂养的WT和KLF10AKO小鼠iWAT；Illumina NovaSeq 6000平台，双端150 bp，目标深度20 million read pairs/样本；差异基因阈值padj≤0.05且|log2(foldchange)|≥1；n=4只小鼠/组 阅读提示：Methods中RNA-seq analysis小节及Fig. 5a-c图注 |
| 原代脂肪细胞分离和分化 | 3-4周龄KLF10flox/flox雄性小鼠iWAT SVF；分化诱导液含10% FBS、1 μM地塞米松、2 μg/mL胰岛素、0.5 mM IBMX、1 μM罗格列酮处理48 h，随后10% FBS、2 μg/mL胰岛素、1 μM罗格列酮处理48 h，再10% FBS培养2天 阅读提示：Methods中Cell culture and differentiation小节 |