SELEX筛选靶向ZYG11B的DNA适配体
获得特异性结合ZYG11B的适配体候选分子
采用磁珠SELEX进行7轮筛选，每轮以ZYG11B蛋白为正筛选、磁珠为反筛选，富集池经高通量测序分析，选取10条序列进行验证。
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鉴定靶向CRL2ZYG11B E3连接酶的非抑制性适配体配体用于靶向蛋白降解
Identification of a non-inhibitory aptameric ligand to CRL2ZYG11B E3 ligase for targeted protein degradation.
实验完整度
高包含体外结合与功能验证、细胞水平降解实验、机制验证及小鼠移植瘤体内抗肿瘤验证。
主要模型
HEK293T细胞（GFP-HaloTag/NCL过表达） MCF-7乳腺癌细胞 A549肺癌细胞 H1299-R175H稳定细胞系 BALB/c裸鼠A549皮下移植瘤模型
重点核对
Apt#Z6与ZYG11B结合亲和力Kd=4.69±2.19 μM（ITC） Halo-ZATAC#T3降解GFP-HaloTag的DC50=44.15 nM，6 h开始至48 h NCL-ZATAC#20降解NCL的DC50为166.6 nM（外源）和158 nM（内源），4 h开始 R175H-ZATAC#25（500 nM）处理H1299-R175H细胞，12 h开始降解p53-R175H并持续48 h 3WJ-ZATAC#T10（5 mg/kg）隔日尾静脉注射A549荷瘤小鼠，抑制肿瘤生长
摘要
作为蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）的关键元件，E3泛素连接酶的选择显著影响降解效力和选择性。然而，可用于PROTAC开发的E3连接酶库仍未被充分探索，严重限制了靶向蛋白降解的范围。在本研究中，我们鉴定了一种靶向ZYG11B（Cullin 2-RING连接酶复合物的底物受体）的非抑制性适配体，作为靶向蛋白降解的E3弹头。这种基于适配体的PROTAC平台称为ZATAC，通过生物正交化学或自组装可便捷制备，并显示出消除多种不可成药靶蛋白的前景，包括核仁素（NCL）、SRY-box转录因子2（SOX2）和突变型p53-R175H，凸显了其通用性和多功能性。为了将ZATAC特异性递送至癌细胞，我们进一步通过整合一种额外适配体（选择性识别癌细胞表面过表达的蛋白）开发了基于DNA三向接头的ZATAC（3WJ-ZATAC）。3WJ-ZATAC在体内表现出肿瘤特异性分布并实现双靶点降解，从而抑制肿瘤生长而不引起明显毒性。总之，ZATAC代表了一种通用、模块化且直接的靶向蛋白降解平台，为其他未开发的E3连接酶的潜力提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否鉴定靶向CRL2ZYG11B的非抑制性适配体配体，并基于此构建通用、模块化的靶向蛋白降解平台？
- 核心机制
- Apt#Z6结合ZYG11B但不抑制CRL2ZYG11B连接酶活性，ZATAC通过招募ZYG11B与靶蛋白形成三元复合物，经泛素-蛋白酶体途径降解靶蛋白。
- 主要证据
- ITC/SPR/MST证实Apt#Z6与ZYG11B结合；链霉亲和素pull-down和免疫共沉淀证实三元复合物；MG132、过量Apt#Z6和ZYG11B siRNA阻断降解；ZATAC降解NCL、SOX2和p53-R175H并抑制癌细胞增殖；3WJ-ZATAC#T10在A549移植瘤小鼠中抑制肿瘤生长并降解NCL和SOX2。
- 研究意义
- ZATAC拓展了PROTAC可用的E3连接酶库，为利用适配体靶向其他未开发的E3连接酶提供了思路，并展示了靶向递送和双靶点降解的治疗潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
适配体结合亲和力与特异性验证
验证Apt#Z6与ZYG11B的结合亲和力及特异性
用ITC测定候选适配体与ZYG11B的结合，SPR和MST进一步确认Apt#Z6与ZYG11B结合；链霉亲和素pull-down和质谱验证细胞内结合特异性。
验证Apt#Z6不抑制CRL2ZYG11B连接酶活性
确认Apt#Z6适合作为非抑制性E3配体
使用泛素GPS报告系统检测N-degron-GFP融合蛋白稳定性，免疫印迹检测ZYG11B介导的N-degron-GFP降解及ZYG11B、JAK2蛋白水平。
构建Halo-ZATAC并验证GFP-HaloTag降解
验证Apt#Z6用于靶向蛋白降解的可行性
将DBCO修饰的HaloTag配体与叠氮修饰的Apt#Z6通过点击化学偶联构建Halo-ZATAC#Tn，在GFP-HaloTag表达HEK293T细胞中检测降解。
构建双特异性ZATAC并验证NCL、SOX2和p53-R175H降解
验证ZATAC平台的通用性
将靶向NCL的AS1411、靶向SOX2的适配体和靶向p53-R175H的p53-mDA分别与Apt#Z6自组装，构建NCL-ZATAC、SOX2-ZATAC和R175H-ZATAC，在MCF-7、A549和H1299-R175H细胞中检测靶蛋白降解。
机制验证：三元复合物形成和泛素-蛋白酶体依赖性
验证ZATAC通过ZYG11B和泛素-蛋白酶体途径降解靶蛋白
MST检测NCL-ZATAC#20与GFP-NCL的二元结合及与ZYG11B预孵育后的三元结合；链霉亲和素pull-down和免疫共沉淀检测三元复合物；MG132、过量Apt#Z6、ZYG11B siRNA和CQ验证降解途径。
构建三特异性3WJ-ZATAC并验证靶向递送和双靶点降解
实现肿瘤特异性递送和双靶点降解
以DNA三向接头为框架，整合AS1411或Sgc8c递送适配体与Apt#Z6及靶蛋白适配体，构建3WJ-ZATAC，在A549和H1299-R175H细胞中检测摄取和双靶点降解。
体内肿瘤特异性分布和抗肿瘤效果验证
评估3WJ-ZATAC#T10的体内分布和抗肿瘤活性
A549皮下移植瘤BALB/c裸鼠尾静脉注射Cy5-3WJ-ZATAC#T10进行活体成像，隔日尾静脉注射PBS、3WJ-ScrApt#Z6或3WJ-ZATAC#T10，监测肿瘤体积和体重，终点进行组织病理和免疫组化分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化 | pET28-MKH8SUMO载体 | Addgene | 79526 |
| 镍-次氮基三乙酸琼脂糖珠 | -- | -- | |
| HiTrap Q HP层析柱 | GE Healthcare | -- | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL层析柱 | GE Healthcare | -- | |
| 等温滴定量热法 | MicroCal PEAQ-ITC系统 | Malvern Panalytical | -- |
| 表面等离子体共振 | Biacore T200系统 | GE Healthcare | -- |
| 微量热泳动 | Monolith NT.115仪器 | NanoTemper Technologies | -- |
| 流式分析 | ACEA NovoCyte流式细胞仪 | ACEA Biosciences, Inc. | -- |
| 细胞培养与转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | MilliporeSigma | -- |
| 免疫印迹 | 抗NCL抗体 | Proteintech | 10556-1-AP |
| 抗SOX2抗体 | Abways | CY5268 | |
| 免疫组织化学 | 抗SOX2抗体 | Proteintech | 11064-1-AP |
| 免疫印迹 | 抗p53抗体 | Proteintech | 60283-2-Ig |
| 抗ZYG11B抗体 | ImmunoWay | YN4251 | |
| 抗His抗体 | Proteintech | 66005-1-Ig | |
| 抗GFP抗体 | Abmart | P30010 | |
| 抗GAPDH抗体 | Abcam | ab8245 | |
| 抗Flag抗体 | ABclonal | AE024 | |
| 抗RFP抗体 | ABclonal | AE020 | |
| 免疫组织化学 | 抗Ki67抗体 | Abways | CY5542 |
| 抗BAX抗体 | Abmart | T40051 | |
| 免疫印迹 | 抗JAK2抗体 | Cell Signaling Technology | 3230 |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A/G琼脂糖珠 | Beyotime | P2055 |
| 链霉亲和素pull-down | 链霉亲和素琼脂糖珠 | MilliporeSigma | -- |
| 血清稳定性 | GelRed核酸染料 | -- | -- |
| 细胞增殖 | CCK-8试剂盒 | MedChemExpress | -- |
| EdU掺入 | EdU试剂盒 | RiboBio | -- |
| 体内成像 | Syngene PXi成像系统 | Synoptics Technologies Ltd. | -- |
| 免疫组织化学 | DAB显色剂 | Servicebio | -- |
| HRP标记抗小鼠和抗兔二抗 | Servicebio | -- | |
| 细胞培养 | 基质胶 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 适配体筛选与结合验证 | SELEX筛选轮次（7轮）、正反筛选策略（ZYG11B蛋白/磁珠）、ITC蛋白浓度50–70 µM和适配体浓度0.5–1.4 mM、SPR浓度范围0.003–100 µM 阅读提示：Methods中SELEX、ITC、SPR小节及Supplementary Table 1 |
| Halo-ZATAC降解GFP-HaloTag | 连接子胸苷数（#T3和#T5有效）、处理浓度500 nM、处理时间24 h、MG132浓度20 µM、ZYG11B siRNA转染 阅读提示：Fig. 2图注及Results中Halo-ZATAC部分 |
| 双特异性ZATAC降解NCL、SOX2和p53-R175H | 连接子长度（NCL-ZATAC#20为20 bp，SOX2-ZATAC#20为20 bp，R175H-ZATAC#25为25 bp）、处理浓度500 nM、MG132 20 µM、CQ 10 µM、CHX 10 µg/mL 阅读提示：Fig. 3、Fig. 4、Fig. 5图注及Methods中细胞培养与转染小节 |
| 3WJ-ZATAC靶向递送和双靶点降解 | 3WJ-ZATAC#T10浓度1000 nM、处理时间24 h、MG132 20 µM、AS1411或Sgc8c递送适配体 阅读提示：Fig. 6图注及Results中三特异性ZATAC部分 |
| 体内抗肿瘤实验 | 小鼠品系（5周龄雌性BALB/c裸鼠）、A549细胞于50% Matrigel皮下注射、给药剂量5 mg/kg、隔日尾静脉注射、成像时间点2、4、6、12 h、随机分组 阅读提示：Methods中Animal experiments小节及Fig. 7图注 |