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        肝纤维化对小鼠肝细胞体内基因转移的负面影响

        Liver fibrosis negatively impacts in vivo gene transfer to murine hepatocytes.

        作者信息Chiara Simoni, Justine Nozi, Francesco Starinieri, Tiziana La Bella, Elisabetta Manta, Camilla Negri, Mauro Biffi, Rossana Norata, Martina Rocchi, Francesca Sanvito, Giuseppe Ronzitti, Elena Barbon, Alessio Cantore
        PMID40064848
        期刊Nat Commun
        发布时间2025-03-10
        DOI10.1038/s41467-025-57383-8
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        使用化学诱导和遗传性肝纤维化小鼠模型，结合LV和AAV载体，通过hFIX表达、mCherry阳性面积、VCN和肝小叶分布等多层次功能与机制验证。

        主要模型

        CCl4诱导的C57BL/6小鼠肝纤维化模型 DDC饮食诱导的C57BL/6小鼠胆汁性肝纤维化模型 Abcb11−/−小鼠（PFIC-2模型） Agl−/−小鼠（GSDIII模型）

        重点核对

        CCl4剂量0.6 μL/g体重，腹腔注射，处理3或6周 DDC饮食浓度0.1% (w/w)，喂养3或5周 LV.hFIX剂量3.5×10^10 TU/kg或5×10^10 TU/kg；LV.mCherry剂量1.5×10^10、3.5×10^10、4×10^10或5×10^10 TU/kg AAV.hFIX剂量5×10^11或2×10^11 vg/kg；AAV.mCherry剂量1×10^11 vg/kg 载体给药后4周或2周（遗传模型）检测mCherry阳性肝面积和VCN

        摘要

        肝纤维化发生于多种遗传性和获得性疾病，导致组织和代谢改变，可能对病毒载体介导的基因治疗产生不利影响。在此，我们评估了肝纤维化对慢病毒载体或腺相关病毒载体介导的肝细胞体内基因转移的影响。我们利用了两种化学诱导的纤维化小鼠模型，其特征是肝小叶不同区域的组织损伤。此外，我们使用 Abcb11–/– 和 Agl−/− 小鼠作为遗传性胆汁淤积和糖原贮积病的代表性模型，这些模型以肝纤维化为特征。我们报告肝纤维化对肝细胞转导的普遍负面影响以及载体在肝小叶内分布的改变，根据所用病毒载体和载体给药时肝脏状态的不同而结果不同。本研究对体内肝脏定向基因治疗的未来开发和应用具有启示意义。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        肝纤维化是否影响慢病毒载体和腺相关病毒载体介导的肝细胞体内基因转移？
        核心机制
        肝纤维化通过改变肝小叶结构和微环境，可能形成物理屏障并改变代谢状态，从而降低肝细胞转导效率并改变载体在肝小叶内的分布；LV和AAV因载体大小和嗜性不同受影响程度不同。
        主要证据
        在CCl4和DDC诱导的肝纤维化小鼠模型及Abcb11−/−和Agl−/−遗传模型中，LV和AAV载体给药后检测血浆hFIX水平、mCherry阳性肝面积和VCN，发现肝纤维化普遍降低肝细胞转导，且LV在CCl4模型中降低而AAV不受影响，DDC模型中两者均降低；LV的肝细胞VCN与转基因输出相关。
        研究意义
        研究提示肝纤维化存在时需考虑增加载体剂量、尽早给药并根据纤维化类型和阶段选择载体平台，对肝脏定向基因治疗和基因编辑策略的开发具有指导意义。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        建立化学诱导肝纤维化模型

        诱导小鼠肝纤维化并确认肝损伤和纤维化程度

        对C57BL/6小鼠腹腔注射CCl4（溶于玉米油）或喂养含DDC的饮食，通过血清ALT/AST和肝组织病理学（天狼星红染色）评估肝损伤和纤维化。

        2

        给予病毒载体并监测转基因表达

        评估肝纤维化对LV和AAV载体介导的肝细胞基因转移效率的影响

        在最后一次CCl4注射或停止DDC饮食后1周，通过眶后静脉注射LV.hFIX、LV.mCherry、AAV.hFIX或AAV.mCherry，纵向监测血浆hFIX，4周后收集肝脏检测mCherry阳性面积和VCN。

        3

        评估LV在肝细胞亚群和器官中的分布

        确定肝纤维化是否改变LV的清除、组织分布和肝细胞转导

        在CCl4和DDC模型中注射LV.hFIX或LV.mCherry，于30分钟、60分钟和24小时采集血液监测LV p24清除，5周后收集主要器官并通过FACS分选肝细胞、Kupffer细胞、肝窦内皮细胞和肝星状细胞进行VCN分析。

        4

        在遗传性肝纤维化模型中验证

        评估遗传性疾病相关肝纤维化对LV和AAV载体转导的影响

        对6月龄Abcb11−/−小鼠和9月龄Agl−/−小鼠及其野生型对照注射LV.mCherry或AAV.mCherry，2周后检测mCherry阳性肝面积和VCN。

        5

        分析载体在肝小叶内的分布

        研究肝纤维化是否改变载体转导的肝小叶分区偏好

        对上述实验的肝组织进行免疫荧光染色，用CK7标记门管区，用GS标记中央静脉区，分析mCherry阳性面积在门管区和中央静脉区的分布。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        组织病理学天狼星红染色免疫组织化学血清ALT/AST/ALP检测
        验证分子表达变化
        酶联免疫吸附测定微滴式数字PCR
        验证细胞功能变化
        流式细胞术荧光激活细胞分选
        验证机制链路
        免疫荧光成像共聚焦显微镜
        数据分析与统计
        Mann–Whitney检验Kruskal–Wallis检验Wilcoxon符号秩检验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养Iscove改良Dulbecco培养基Corning--
        胎牛血清Euroclone--
        青霉素/链霉素Lonza--
        LV生产Vivaflow 200切向流过滤膜包100 kDaSartorius--
        聚异质同晶管Beckman--
        gDNA提取Maxwell RSC培养细胞DNA试剂盒PromegaAS1620
        Maxwell RSC组织DNA试剂盒PromegaAS1610
        DNeasy血液与组织试剂盒Qiagen69504
        小鼠实验3,5-二乙氧羰基-1,4-二氢可力丁Sigma-Aldrich137030
        基因分型QuickExtract DNA提取液Biosearch technologies--
        血清生化检测ALT对照品Instrumentation Laboratory0018257440
        AST对照品Instrumentation Laboratory0018257540
        ALP对照品Instrumentation Laboratory18259740
        SeraChem对照品1级Instrumentation Laboratory0018162412
        SeraChem对照品2级Instrumentation Laboratory0018162512
        免疫组织化学兔单克隆抗CK19抗体克隆EP1580YAbcam--
        ELISAFIX-EIA配对抗体组Affinity Biologicals--
        免疫荧光Hoechst 33342Life technologiesH3570
        Fluoromount-G封片剂Invitrogen--
        mCherry抗体Abcamab205402
        CK7抗体Abcamab181598
        GS抗体Novus BioNB110-4104
        鸡IgY AF546InvitrogenA11040
        兔IgG AF647InvitrogenA31573
        流式细胞术CD31 APCBD Biosciences551262
        CD45 APCBD Biosciences559864
        FC封闭剂BD Biosciences553142
        CD31 FITCBD Biosciences551262
        CD45 BV786BD Biosciences563686
        F4/80 PEBD Biosciences553142
        CD45R/B220 PE-Cy5BD Biosciences553091
        CD11c PE-Cy7Invitrogen25-0114-82
        LV p24检测Simple Plex HIV-1 Gag p24检测卡R&D systemsSPCKB-PS-000981

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        化学诱导肝纤维化模型
        CCl4剂量0.6 μL/g体重，腹腔注射，处理3或6周；DDC饮食浓度0.1% (w/w)，喂养3或5周；对照为玉米油或标准饮食
        阅读提示：Methods 中 Mice experiments 小节
        病毒载体给药
        LV和AAV载体剂量（LV.hFIX 3.5×10^10或5×10^10 TU/kg，LV.mCherry 1.5×10^10至5×10^10 TU/kg，AAV.hFIX 5×10^11或2×10^11 vg/kg，AAV.mCherry 1×10^11 vg/kg）；给药途径为眶后静脉或尾静脉注射
        阅读提示：Methods 中 Mice experiments 小节及图1b、2b、3a、4c图注
        遗传模型实验
        Abcb11−/−小鼠6月龄，Agl−/−小鼠9月龄；LV.mCherry剂量3.5×10^10或5×10^10 TU/kg，AAV.mCherry剂量1×10^11 vg/kg；给药后2周检测
        阅读提示：Methods 中 Mice experiments 小节及图5图注
        转导效率检测
        血浆hFIX浓度（ELISA）；mCherry阳性肝面积（免疫荧光/共聚焦）；VCN（ddPCR）；检测时间点：化学模型给药后4周，遗传模型给药后2周
        阅读提示：Methods 中 ELISA、Liver immunofluorescence imaging 和 VCN determination 小节
        肝小叶分布分析
        CK7标记门管区，GS标记中央静脉区，计算mCherry阳性面积比值；分析半径225 μm
        阅读提示：Methods 中 Liver immunofluorescence imaging 小节及图6图注

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