eIF4E工程化蛋白构建与纯化
获得适用于片段筛选的可溶性、可结晶eIF4E蛋白
构建了26种eIF4E序列修饰，筛选出将4E-BP1经典结合序列通过甘氨酸 linker 融合到eIF4E L36的融合蛋白（N端1-35残基删除），在大肠杆菌中表达并纯化。
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整合基于片段的筛选与靶向蛋白降解和遗传拯救以探索eIF4E功能
Integrating fragment-based screening with targeted protein degradation and genetic rescue to explore eIF4E function.
实验完整度
高包含X射线晶体学、NMR片段筛选、ITC、细胞裂解物和完整细胞实验、dTAG降解模型及遗传拯救等多层级验证。
主要模型
H1299非小细胞肺癌细胞系 SW620结直肠癌细胞系 HeLa宫颈癌细胞系 eIF4E-dTAG CRISPR敲入H1299单克隆细胞系
重点核对
化合物4的Kd值（ITC测定，n=1或n=2）及LE 化合物4在细胞裂解物中破坏eIF4E:eIF4G相互作用的EC50（SW620 2.6 µM，HeLa 1.4 µM） CETSA实验中化合物4在完整H1299细胞中的EC50（2 µM）及处理时间（6小时） dTAGV-1处理浓度（0.5或1 µM）及时间（6、8、16小时或6天）用于eIF4E降解 遗传拯救实验中eIF4E突变体（W56A、W73F、L85R、L134R、S209A及双突变）的表达水平及功能拯救效果
摘要
真核起始因子4E（eIF4E）是癌基因驱动的蛋白质合成的调控枢纽，被认为是一个有前景的抗癌靶点。本文中，我们针对eIF4E筛选了一个片段文库，并鉴定出一个功能此前未知的配体结合位点。后续基于结构的设计产生了一个低纳摩尔工具化合物（4，Kd = 0.09 µM；LE 0.38），该化合物破坏eIF4E:eIF4G相互作用，在细胞裂解物中抑制翻译，并在完整细胞中展示出与eIF4E的靶点结合（EC50 = 2 µM）。通过将靶向蛋白降解与使用eIF4E突变体的遗传拯救相结合，我们表明，破坏经典的eIF4G和非经典结合位点可能都是驱动强细胞效应所必需的。这项工作凸显了基于片段的药物发现识别难以成药蛋白中口袋的能力，以及如何将该方法与遗传表征和降解剂技术相结合，以在复杂生物系统中探究蛋白质功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- eIF4E上是否存在新的可成药口袋，以及该位点的配体结合或突变如何影响eIF4E功能？
- 核心机制
- 化合物4结合eIF4E位点2诱导α1螺旋延伸和柔性环构象变化，破坏eIF4E:eIF4G相互作用；同时破坏经典eIF4G结合位点和非经典位点（位点2）可能是驱动强细胞效应所必需的。
- 主要证据
- 通过X射线晶体学和NMR片段筛选发现位点2；化合物4在细胞裂解物中破坏eIF4E:eIF4G相互作用并抑制帽依赖性翻译；CETSA显示细胞中靶点结合；dTAG降解模型联合eIF4E突变体（L85R、L134R、W73F/L85R）遗传拯救实验表明位点2突变影响eIF4E功能；化合物4与W73F突变协同抑制增殖。
- 研究意义
- 展示了基于片段的药物发现识别难成药蛋白口袋的能力，以及将该方法与遗传表征和降解剂技术结合探究复杂生物系统中蛋白质功能的潜力；提示可能需要破坏eIF4E的经典和非经典区域才能驱动强细胞功能效应。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
片段筛选与结合位点鉴定
筛选与eIF4E结合的片段并定位结合位点
使用1371个片段文库，通过配体观察NMR和X射线晶体学筛选，鉴定出50个片段 hits，主要结合在位点2。
基于结构的先导化合物优化
提高片段亲和力并获得工具化合物
通过结构导向设计，从化合物1逐步优化到化合物4，并合成阴性对照化合物5。
细胞裂解物中eIF4E:eIF4G相互作用和翻译抑制验证
验证化合物4是否破坏eIF4E:eIF4G相互作用并抑制帽依赖性翻译
在SW620、HeLa和H1299细胞裂解物中，通过共免疫沉淀和电化学发光结合实验检测eIF4E:eIF4G和eIF4E:4E-BP1相互作用；在HeLa裂解物中进行体外翻译实验。
完整细胞中靶点结合和功能验证
验证化合物4在完整细胞中的靶点结合及对eIF4G结合、蛋白质合成和增殖的影响
在H1299细胞中进行CETSA实验检测eIF4E热稳定性；在完整细胞中检测eIF4E:eIF4G相互作用；双报告基因实验检测蛋白质合成；细胞活力实验检测增殖。
eIF4E位点2突变体构建及eIF4G结合验证
通过突变位点2残基验证其对eIF4G结合的影响
构建位点2突变体（L45、Y76、W130、L134、I79、L85）和对照突变体（W56A、W73F、S209A），转染H1299细胞，通过电化学发光实验检测外源FLAG-eIF4E与内源eIF4G结合。
eIF4E dTAG降解模型建立
建立可快速降解内源eIF4E的细胞模型以进行遗传拯救实验
在H1299细胞中表达FKBP12F36V标记的eIF4E，用CRISPR/Cas9敲除内源eIF4E，分离单克隆，用dTAGV-1降解eIF4E-dTAG。
遗传拯救实验验证eIF4E突变体功能
在eIF4E降解背景下表达野生型或突变体eIF4E，验证其拯救MCL1表达和细胞增殖的能力
在C3-1克隆中转染野生型或突变体eIF4E，用dTAGV-1降解内源eIF4E-dTAG，检测MCL1蛋白表达和细胞增殖。
化合物4与W73F突变协同效应验证
验证化合物4处理与W73F突变是否协同影响eIF4E功能
在C3-1克隆、W73F和L85R拯救模型中，联合dTAGV-1和化合物4处理，检测MCL1表达和细胞增殖。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | HisTrap Fast Flow Crude | Cytiva | -- |
| 蛋白纯化 | Superdex 200 | GE Healthcare | -- |
| 结晶 | Greiner CrystalQick蛋白结晶板 | Greiner | -- |
| NMR片段筛选 | Bruker 500 MHz Avance波谱仪 | Bruker | -- |
| 等温滴定量热法 | MicroCal VP-ITC | MicroCal | -- |
| MicroCal Auto-ITC200 | MicroCal | -- | |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Fisher Scientific | 21875-034 |
| DMEM + Glutmax培养基 | Fisher Scientific | 61965-026 | |
| 胎牛血清 | PAN Biotech | P30-3702 | |
| 非必需氨基酸 | Fisher Scientific | 11140-035 | |
| 共免疫沉淀 | MSD裂解缓冲液 | -- | -- |
| complete mini片剂蛋白酶抑制剂 | Roche | 11836153001 | |
| RIIY 4E-BP1肽 | Peptide Protein Research | -- | |
| 单克隆抗eIF4E抗体 | R&D Systems | MAB3228 | |
| Lightning-Link试剂盒 | R&D Systems Inc. | 371-0010 | |
| 链霉亲和素磁珠 | Pierce | 88817 | |
| 电化学发光结合实验 | 链霉亲和素包被96孔High Bind SECTOR板 | MSD | L15SB-2 |
| Multiarray SECTOR板 | MSD | L15XB | |
| 抗FLAG M2抗体 | Sigma-aldrich | F1804 | |
| MSD洗涤缓冲液 | MSD | R61AA-1 | |
| MSD封闭缓冲液 | MSD | R93AA | |
| 兔抗eIF4E抗体 | Cell Signalling | 9742 | |
| 兔抗eIF4G抗体 | CST | 2469 | |
| 兔抗4E-BP1抗体 | CST | 9452 | |
| 山羊抗兔Sulfo-Tag | MSD | R32AB-1 | |
| Read Buffer T4X | MSD | R92-TC2 | |
| MSD QuickPlex SQ 120板阅读仪 | MSD | -- | |
| 体外翻译实验 | HeLa体外翻译实验试剂盒 | Thermo Fisher | 88882 |
| Message Machine T7 Ultra转录试剂盒 | Thermo Fisher | AM1345 | |
| RNeasy柱 | Qiagen | 74204 | |
| Dual Glo荧光素酶报告基因检测 | Promega | E2920 | |
| RNAsin | Promega | N2115 | |
| 96孔PCR板 | Starlab | I1402-9700 | |
| 白色96孔检测板 | Corning | 3917 | |
| topcount NXT微孔板阅读仪 | Perkin Elmer | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Fisher Scientific | L3000008 |
| 病毒文库 | 慢病毒shRNA全基因组文库 | Dharmacon SMARTvector | -- |
| QIAgen血液和细胞培养DNA Maxi试剂盒 | QIAgen | 13362 | |
| Phusion Hot Start II DNA聚合酶 | Fisher Scientific | F-549L | |
| SMARTvector正向和反向索引PCR引物 | Dharmacon | PRM7668 | |
| QIAquick凝胶提取试剂盒 | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA HS检测 | Fisher Scientific | Q57851 | |
| dTAG和CRISPR克隆 | Neon转染系统 | -- | MPK10096 |
| Gateway克隆 | pDONR221入门克隆 | Fisher Scientific | 12536017 |
| LR Clonase II酶混合物 | Fisher Scientific | 11791020 | |
| DH5α文库效率感受态细胞 | Fisher Scientific | 18263012 | |
| QIAGEN质粒Maxi试剂盒 | QIAGEN | 12123 | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | Fisher Scientific | A1113802 |
| 潮霉素 | Fisher Scientific | 10687010 | |
| 实时细胞成像 | IncuCyte ZOOM活细胞成像系统 | Essen BioSciences | -- |
| 细胞活力 | CellTiter-Blue细胞活力检测 | Promega | G8081 |
| PHERAstar板阅读仪 | -- | -- | |
| 免疫印迹 | 细胞裂解缓冲液 | Cell Signaling | 9803 |
| Halt蛋白酶抑制剂混合物 | Fisher Scientific | 78429 | |
| cOmplete蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | 11836153001 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Fisher Scientific | 23225 | |
| NuPAGE 4–12% Bis-Tris凝胶 | Fisher Scientific | NP0336BOX | |
| Invitrogen iBLOT凝胶转移设备系统 | Fisher Scientific | IB21001 | |
| eIF4E抗体 | Cell Signaling | 2067 | |
| MCL1抗体 | Cell Signaling | 39224 | |
| 抗FLAG M2抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| vinculin抗体 | Cell Signaling | 13901 | |
| 抗小鼠HRP | Bio-rad | 1705047 | |
| 抗兔HRP | Sigma-Aldrich | NA934 | |
| SuperSignal West Pico ECL HRP底物 | Fisher Scientific | 34578 | |
| ChemiDoc系统 | Bio-Rad | -- | |
| CETSA | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Fisher Scientific | 1861281 |
| 蛋白质组分析 | eIF4E siRNA | siTOOLS | si-G100-1977 |
| Pierce定量荧光肽检测 | Pierce | 23290 | |
| Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Thermo UltiMate 3000 UHPLC | Thermo | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 片段筛选 | 片段文库大小（1371）、蛋白浓度（21 µM）、片段浓度（500 µM）、NMR实验参数（CPMG，2 ms自旋回波，300次重复） 阅读提示：Methods中的NMR fragment screen小节 |
| 化合物4细胞裂解物活性 | 细胞系（SW620、HeLa、H1299）、化合物浓度范围（1–100 µM）、处理时间（30分钟）、阳性对照肽RIIY和阴性对照肽RIIG 阅读提示：Methods中的Electro-chemiluminescent binding assay和Co-immunoprecipitation assay小节，以及Fig. 4图注 |
| CETSA实验 | 细胞系（H1299）、化合物4处理浓度（50 µM或10、5、1、0.5 µM）和时间（6小时）、加热温度（57.6 °C用于检测） 阅读提示：Methods中的CETSA assay in cells小节和Fig. 5图注 |
| dTAG降解模型 | dTAGV-1浓度（0.5或1 µM）、处理时间（6、8、16小时或6天）、细胞克隆（C2-2、C3-1、N2-1、N3-2） 阅读提示：Methods中的Generation of stable dTAG and eIF4E CRISPR clones小节和Fig. 7图注 |
| 遗传拯救实验 | 转染的eIF4E突变体（W56A、W73F、L85R、L134R、S209A及双突变）、dTAGV-1浓度（0.5或1 µM）、检测时间点（6、16小时或6天） 阅读提示：Methods中的Gene constructs and gateway cloning小节和Fig. 8图注 |