核ANLN与Pol II相互作用的鉴定
验证核ANLN是否与Pol II直接相互作用及其结合区域。
采用免疫荧光、细胞分级分离、BrUTP标记新生RNA、免疫共沉淀、质谱、HA-ANLN缺失突变体免疫共沉淀、体外pulldown和PLA实验检测ANLN与Pol II的相互作用。
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核ANLN调控转录起始相关Pol II聚类及靶基因表达
Nuclear ANLN regulates transcription initiation related Pol II clustering and target gene expression.
实验完整度
高包含体外纯化蛋白相分离、细胞系超级分辨成像、CUT&Tag、RNA-Seq及功能回补等多层验证
主要模型
KYSE150食管鳞癌细胞系 HeLa细胞系 HEK293T细胞系 纯化重组ANLN与Pol II CTD蛋白
重点核对
Dox诱导ANLN快速敲低KYSE150细胞：2 μg/mL Dox处理24 h THZ1处理KYSE150细胞：0.1 μM处理3 h用于超级分辨成像 1,6-HD处理HeLa细胞：5% 1,6-HD处理60 s 体外相分离实验：CTD-mEGFP 5 μM与不同浓度ANLN-mCherry在含16% dextran的相分离缓冲液中25°C孵育30 min RNA-Seq与CUT&Tag分析：ANLN敲低24 h和48 h后收集样本
摘要
Anillin（ANLN）是一种调控收缩环组装的丝裂期蛋白，已被报道为癌蛋白。然而，ANLN在癌细胞中、尤其是细胞核内的功能尚未被完全理解。在此，我们报道了核ANLN在基因转录调控中的作用。我们发现核ANLN直接与RNA聚合酶II（Pol II）大亚基相互作用以形成转录凝聚体。ANLN增强起始型Pol II聚类并促进Pol II CTD相分离。短期敲低ANLN改变Pol II的染色质结合和增强子介导的转录活性。ANLN-Pol II轴的靶基因参与氧化还原酶活性、Wnt信号传导和细胞分化。THZ1，一种超级增强子抑制剂，特异性抑制ANLN-Pol II聚类、靶基因表达和食管鳞状细胞癌（ESCC）细胞增殖。我们的结果揭示了核ANLN在转录调控中的功能，为ESCC治疗提供了理论基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 核ANLN在癌细胞中是否以及如何直接调控基因转录，尤其是与Pol II聚类和靶基因表达的关系。
- 核心机制
- 核ANLN直接结合Pol II大亚基的CTD和846-1592 aa区域，通过其IDR中46个关键相分离驱动氨基酸促进Pol II CTD相分离和起始型Pol II聚类，进而调控超级增强子介导的靶基因表达。
- 主要证据
- 体外纯化蛋白液滴实验显示ANLN以浓度依赖方式增大CTD凝聚体并促进相分离；超级分辨成像显示ANLN敲低特异性减少Pol II-pS5 type III聚类，可被ANLN WT而非PS mut回补；CUT&Tag和RNA-Seq鉴定出84个ANLN-Pol II轴直接靶基因，ChIP-qPCR验证其启动子结合；THZ1处理溶解ANLN-Pol II type III聚类并抑制靶基因表达和ESCC细胞活力。
- 研究意义
- 揭示了核ANLN作为转录调控因子促进Pol II起始聚类和靶基因表达的功能，为靶向ANLN-Pol II轴的ESCC治疗提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ANLN与Pol II的基因组共定位及凝聚体特征分析
确定ANLN与Pol II在基因组上的共定位区域及凝聚体的物理性质。
在KYSE150细胞中进行ANLN和Pol II的CUT&Tag，在HeLa和KYSE150细胞中进行超级分辨成像，并用1,6-HD处理观察凝聚体变化。
ANLN对Pol II起始聚类的影响及结构域依赖性
验证ANLN是否促进起始型Pol II聚类，并确定依赖的关键氨基酸区域。
使用siRNA或Dox诱导快速敲低ANLN，通过超级分辨成像分析Pol II-pS5聚类；回补ANLN WT、NLS突变体、actin结合缺陷突变体和PS突变体；用PONDR和PSPHunter预测IDR和相分离驱动序列。
ANLN促进Pol II CTD相分离的体外验证
在体外验证ANLN是否直接促进Pol II CTD相分离及其关键残基的作用。
原核表达纯化CTD-mEGFP、ANLN-mCherry及其PS突变体，进行液滴实验、FRAP、RNA/DNA干扰实验和时钟扫描分析。
ANLN对基因转录活性和Pol II染色质结合的影响
评估ANLN敲低对全局基因表达、Pol II染色质结合和增强子活性的影响。
RNA-Seq分析ANLN敲低后的基因表达变化；CUT&Tag检测Pol II和H3K27ac在TSS和超级增强子区域的信号；染色质结合生化实验检测Pol II与染色质的亲和力；双荧光素酶报告基因检测Pol II活性；DNA FISH结合免疫荧光观察靶基因位点。
ANLN-Pol II轴直接靶基因的鉴定与验证
鉴定由ANLN-Pol II轴直接调控的靶基因及其与超级增强子和转录因子的关系。
结合RNA-Seq和CUT&Tag筛选具有ANLN占据且表达受ANLN敲低影响的基因；ChIP-qPCR验证ANLN和Pol II在靶基因启动子的结合；RT-qPCR验证靶基因表达；利用公共数据库分析超级增强子和转录因子共定位。
THZ1对ANLN-Pol II聚类和ESCC细胞增殖的抑制效果
验证超级增强子抑制剂THZ1是否靶向ANLN-Pol II轴并抑制ESCC细胞增殖。
用THZ1处理KYSE150细胞，超级分辨成像观察ANLN和Pol II聚类；分析公共THZ1处理ESCC细胞转录组数据；RT-qPCR验证靶基因表达；MTS实验检测THZ1对ESCC细胞系和正常细胞系的活力影响；F806与THZ1联合处理评估效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | GIBCO | -- | |
| DMEM培养基 | GIBCO | -- | |
| 内皮细胞培养基 | ScienCell | -- | |
| siRNA转染 | Opti-MEM减血清培养基 | Life Technologies | 31985070 |
| siRNA转染试剂 | Life Technologies | 13778150 | |
| 药物处理 | 1,6-己二醇 | Sigma | 240117 |
| THZ1 | MedChemExpress | HY-80013 | |
| Western blotting | 抗ANLN抗体 | Abcam | ab211872 |
| 抗总Pol II抗体 | Abcam | ab26721 | |
| 抗Pol II-pS5抗体 | Abcam | ab5131 | |
| 抗Pol II-pS2抗体 | Abcam | ab238146 | |
| 抗TBP抗体 | Abcam | ab220788 | |
| 抗CDK7抗体 | Abcam | ab256787 | |
| 抗Lamin B1抗体 | Proteintech | 66095-1-Ig | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4499S | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Proteintech | HRP-66031 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗GFP标签抗体 | Proteintech | HRP-66002 | |
| 抗His标签抗体 | TransGen Biotech | HT501-01 | |
| 抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | C29F4 | |
| ECL底物 | Biosharp | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa fluor 647驴抗兔IgG | Jackson | 711-605-152 |
| Alexa fluor 488驴抗鼠IgG | Jackson | 715-545-150 | |
| DAPI | Beyotime | C1005 | |
| 抗淬灭封片剂 | Beyotime | P0126 | |
| PLA assay | 邻近连接实验试剂 | Sigma | -- |
| 免疫共沉淀 | ANLN抗体 | Santa Cruz | sc-271814 |
| 正常小鼠IgG | Santa Cruz | sc-2025 | |
| 蛋白A/G磁珠 | MedChemExpress | HY-K0202 | |
| HA磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88837 | |
| 蛋白表达纯化 | Transetta (DE3)化学感受态细胞 | TransGen Biotech | CD801-03 |
| 异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷 | Amresco | 0487 | |
| 溶菌酶 | Sigma | 62971 | |
| GST结合树脂 | Millipore | 70541-5 | |
| His结合树脂 | Millipore | 70666-3 | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| 液滴实验 | 基因组DNA小量制备试剂盒 | Biomiga | GD2211-01 |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 质谱分析 | 纳升液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1200 |
| Orbitrap Eclipse三合一质谱仪 | -- | -- | |
| CUT&Tag | CUT&Tag试剂盒 | Vazyme | TD904 |
| RT-qPCR | HiScript III第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme | R312 |
| ChamQ Universal SYBR-qPCR预混液 | Vazyme | Q711 | |
| ABI 7500实时PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 双荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统试剂盒 | Promega | -- |
| GloMax™ 96微孔板发光检测仪 | Promega | -- | |
| ChIP-qPCR | Qubit双链DNA检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q33231 |
| MTS实验 | CellTiter 96® Aqueous One Solution细胞增殖检测试剂盒 | Promega | G3581 |
| Multiskan MK3酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ANLN快速敲低 | Dox浓度2 μg/mL，处理时间24 h；shRNA靶向ANLN 3' UTR；细胞系KYSE150 阅读提示：Methods 'Cell culture, cell lines generation and cell treatments'及Supplementary fig. 3 |
| THZ1处理与超级分辨成像 | THZ1浓度0.1 μM，处理3 h；细胞系KYSE150；聚类分析阈值排除小于12675 nm²的簇 阅读提示：Methods 'Cell culture, cell lines generation and cell treatments'及Fig. 7A–D |
| 体外相分离液滴实验 | CTD-mEGFP 5 μM，ANLN-mCherry不同浓度；相分离缓冲液含20 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl、16% dextran；25°C孵育30 min 阅读提示：Methods 'Droplet assay'及Fig. 4 |
| CUT&Tag | 细胞量1×10^5；抗体ANLN、Pol II或H3K27ac；测序平台Illumina NovaSeq；分析使用GRCh38/hg38 阅读提示：Methods 'CUT & Tag and data analysis'及Fig. 2、5、6 |
| RNA-Seq | ANLN敲低24 h和48 h；测序平台Illumina HiSeq Xten PE150；差异分析DESeq2 阅读提示：Methods 'RNA-Seq and data analysis'及Fig. 5A |