全基因组CRISPR/Cas9敲除筛选
鉴定EA H1N1 SIV感染所需的宿主因子。
在PK-15-Cas9细胞中转导猪全基因组sgRNA文库，用EA H1N1 SIV（HuB/H1N1）多次感染，收集存活细胞并测序，MAGeCK分析富集基因。
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GGCX促进欧亚类禽H1N1猪流感病毒对跨物种受体的结合适应性
GGCX promotes Eurasian avian-like H1N1 swine influenza virus adaption to interspecies receptor binding.
实验完整度
高全基因组CRISPR筛选、细胞模型、小鼠模型及LC-MS机制验证，含功能与机制验证。
主要模型
PK-15猪肾细胞 NPTr新生猪气管细胞 A549人肺泡上皮细胞 BALB/c小鼠
重点核对
GGCX-KO细胞中病毒滴度（TCID50）较WT细胞降低 GGCX敲低小鼠中病毒滴度、体重损失和存活率 抗Gla抗体免疫沉淀检测HA羧化修饰 LC-MS鉴定HA羧化位点及E225A突变假病毒结合活性 HA 225E/225D/225G病毒连续传代后测序
摘要
欧亚类禽（EA）H1N1猪流感病毒（SIV）由于对人型α-2,6唾液酸（SA）受体亲和力增强，具有引发下一次流感大流行的能力。然而，EA H1N1 SIV受体结合偏好转换的分子机制尚不清楚。本研究利用EA H1N1 SIV在猪肾细胞中进行全基因组CRISPR/Cas9敲除筛选。敲除γ-谷氨酰羧化酶（GGCX）可通过抑制病毒血凝素（HA）的羧化修饰及子代病毒的黏附，在体外和体内降低病毒复制，最终阻碍EA H1N1 SIV的复制。此外，GGCX被揭示为EA H1N1 SIV D225E替换的决定因素，GGCX介导的HA 225E羧化修饰有助于EA H1N1 SIV对α-2,6 SA受体的结合适应。综上所述，我们的CRISPR筛选阐明了GGCX在支持EA H1N1 SIV适应结合α-2,6 SA受体中的新功能。因此，GGCX成为抗EA H1N1 SIV感染和传播的潜在抗病毒靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- EA H1N1 SIV受体结合偏好从α-2,3 SA向α-2,6 SA转换的分子机制及驱动HA 225E适应的宿主因子是什么？
- 核心机制
- GGCX催化病毒HA蛋白（特别是225E位点）的羧化修饰，促进子代病毒对α-2,6 SA受体的结合，并介导HA 225E替换。
- 主要证据
- 全基因组CRISPR筛选鉴定GGCX；GGCX-KO抑制病毒复制（体外和体内）；Co-IP和LC-MS证实GGCX与HA互作及羧化位点；假病毒和突变病毒实验证明225E羧化影响α-2,6 SA结合；传代实验显示GGCX-KO细胞中HA 225D/G不能回复为225E。
- 研究意义
- 揭示GGCX在EA H1N1 SIV受体结合适应中的新功能，为抗病毒干预提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
GGCX敲除细胞系构建与病毒复制验证
验证GGCX对EA H1N1 SIV复制的影响。
用CRISPR/Cas9构建GGCX-KO PK-15、NPTr、A549细胞，感染多种IAV株，测定病毒滴度；回补GGCX检测病毒复制恢复。
小鼠体内GGCX敲低实验
验证GGCX在体内对EA H1N1 SIV感染的影响。
鼻腔给予胆固醇偶联2'-OME修饰的si-GGCX或si-NC，用HuN/H1N1挑战小鼠，监测体重、存活、肺病毒滴度和病理。
GGCX与HA互作及羧化修饰验证
验证GGCX是否催化病毒HA的羧化修饰。
感染病毒后，用抗Gla抗体免疫沉淀羧化蛋白，western blot检测HA；用抗Flag、抗HA或抗GGCX抗体进行Co-IP验证互作。
子代病毒受体结合活性分析
验证GGCX介导的HA羧化对子代病毒结合α-2,6 SA受体的影响。
从WT或GGCX-KO细胞制备Gla或Glu子代病毒，感染细胞后用免疫荧光、流式细胞术检测HA结合；ELISA检测与α-2,3和α-2,6 SA受体的结合。
HA羧化位点鉴定及功能验证
鉴定HA上GGCX介导的关键羧化位点及其对受体结合的作用。
LC-MS鉴定HA羧化位点；构建羧化位点突变假病毒，检测感染性；构建HA 225E/D/G突变病毒，检测结合活性。
HA 225E替换的传代适应实验
验证GGCX是否介导EA H1N1 SIV HA 225E替换。
将HA 225E、225D、225G病毒及自然HA 225D/225G病毒在WT和GGCX-KO细胞中连续传代，测序分析HA 225位点变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | HyClone | SH30809.01 |
| 最低必需培养基 | HyClone | SH30265.01 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | HyClone | SH30243.01 | |
| 胎牛血清 | ExCell | FSP500 | |
| CRISPR筛选 | 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A4161 |
| 病毒培养 | TPCK | Sigma-Aldrich | 4370285 |
| 细胞培养 | 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | Dojindo Molecular Technologies | CK04-500T |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 |
| 病毒培养 | TPCK处理胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T1426 |
| 免疫共沉淀 | NP-40裂解液 | Beyotime | P0013F |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 04693132001 | |
| Dynabeads磁珠 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-2003 | |
| Western blot | 兔抗GGCX抗体 | Proteintech | 16209-1-AP |
| 鼠抗Gla抗体 | Biomedica | 3570 | |
| 鼠抗Flag标签抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| 兔抗BGLAP抗体 | ABclonal | A6205 | |
| 鼠抗GAPDH抗体 | California Bioscience | CB100127 | |
| 兔抗IAV NP抗体 | GeneTex | GTX125989 | |
| 兔抗IAV HA抗体 | GeneTex | GTX127357 | |
| 辣根过氧化物酶标记抗鼠抗体 | Beijing Biodragon Immunotechnologies | BF03001 | |
| 辣根过氧化物酶标记抗兔抗体 | Beijing Biodragon Immunotechnologies | BF03008 | |
| 免疫荧光 | 山羊抗兔Cy3标记IgG | ABclonal | AS007 |
| 4′,6′-二脒基-2-苯基吲哚 | Beyotime | C1002 | |
| 受体结合活性试验 | Neu5Acα2-3Galβ1-4Glcβ-sp4-PAA-生物素 | GlycoNZ | 0060-BP |
| Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ-sp3 | GlycoNZ | 0997-BP | |
| 预包被链霉亲和素的高容量板 | Thermo Scientific | 15,500 | |
| HRP标记兔抗鸡IgG | ABclonal | AS030 | |
| TMB底物 | CWBIO | CW0050S | |
| 流式细胞术 | Cy3标记山羊抗兔IgG | SeraCare | 5230–0359 |
| 荧光素酶试验 | 荧光素酶检测系统 | Promega | E1501 |
| 病毒传代与测序 | pMD-18T载体 | TAKARA Beijing | 6011 |
| pEASY®-Blunt载体 | TransGen | CB101-01 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| 逆转录 | 逆转录酶 | ABclonal | RK20403 |
| qRT-PCR | SYBR GREEN | ABclonal | RK21203 |
| 质粒构建 | BbsI限制酶 | NEB | R3539 |
| BsmBI限制酶 | NEB | R0739 | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 全基因组CRISPR筛选 | 细胞模型：PK-15-Cas9；病毒：HuB/H1N1；MOI：首轮0.01，后续0.1；筛选轮次：4轮；测序轮次：第2、3、4轮 阅读提示：Methods 'Genome-scale CRISPR screening in pig'及Fig. 1a |
| GGCX敲除细胞系构建 | sgRNA序列：文中未明确说明；细胞系：PK-15、NPTr、A549；筛选：FACS或1.5 μg/mL嘌呤霉素；验证：Sanger测序和western blot 阅读提示：Methods 'Generation of GGCX knockout cell line using CRISPR/Cas9'及Supplementary Fig. 2 |
| 病毒滴度测定 | 细胞：MDCK；MOI：0.01或0.1；时间点：文中未明确说明；检测方法：TCID50（Reed-Muench法） 阅读提示：Methods 'Virus infection and titration' |
| 小鼠体内敲低实验 | 小鼠：6周龄雌性BALB/c；siRNA：胆固醇偶联2'-OME修饰，剂量文中未明确说明；给药途径：鼻腔；病毒：HuN/H1N1 30 pfu；监测：14天，n=10 阅读提示：Methods 'Mouse models for GGCX knockdown'及Fig. 2a |
| 免疫共沉淀 | 细胞：PK-15 WT和GGCX-KO；病毒：HuB/H1N1等；MOI：0.01；时间点：9或24 hpi；抗体：抗Gla、抗HA、抗GGCX、抗Flag 阅读提示：Methods 'Western blot and immunoprecipitation'及Fig. 3 |
| 受体结合活性试验 | 病毒：Gla/Glu子代病毒；MOI：5（结合实验）或未明确（ELISA）；受体：α-2,3和α-2,6 SA类似物；检测：ELISA或流式/共聚焦 阅读提示：Methods 'Receptor binding activity assay'和'HA binding assays'及Fig. 4 |
| LC-MS鉴定羧化位点 | 细胞：PK-15 WT和GGCX-KO；病毒：HuB/H1N1；MOI：1；时间点：9 hpi；抗体：抗HA；酶解：胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和ASP-N 阅读提示：Methods 'Liquid chromatography-tandem mass spectrometry'及Fig. 5a |
| 假病毒荧光素酶试验 | 细胞：HEK293T（包装）、PK-15（感染）；质粒：psPAX2、pLenti-luc、HA突变质粒；检测：荧光素酶活性 阅读提示：Methods 'Pseudoviruses packaged and assayed for luciferase activity'及Fig. 5d |
| 病毒传代与测序 | 细胞：PK-15和NPTr WT及GGCX-KO；病毒：HA 225E/D/G及自然分离株；MOI：0.1；传代：5轮，每轮48 h；测序克隆数：10 阅读提示：Methods 'Virus passage and sequencing'及Fig. 6d–g |