筛选可结合Squash的RFP样荧光团
获得具有红移发射且能结合Squash的荧光团。
基于Squash晶体结构，合成DFHO、DFAME、DFIM、DFQL等RFP模拟荧光团，测定其与Squash的结合亲和力和荧光光谱。
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用于体内成像和传感的近红外荧光RNA
Near-infrared fluorogenic RNA for in vivo imaging and sensing.
实验完整度
高包含体外荧光表征、HEK293T等细胞成像、小鼠移植瘤活体成像及传感器功能验证等多层级证据。
主要模型
HEK293T细胞系 MCF-7细胞系 LO2细胞系 BALB/c小鼠皮下移植模型
重点核对
DFQL-1T与Squash结合的表观解离常数KD=56 nM Squash:DFQL-1T复合物激发516 nm、发射654 nm，量子产率0.14 活细胞成像中DFQL-1T使用浓度2 μM或10 μM，孵育1小时 小鼠皮下移植约1×10^8个细胞，移植后2小时原位注射DFQL-1T 10 μM ncRNA传感器在靶标存在下荧光激活6倍（microRNA-21）或5倍（piRNA-36026），检测限0.2 nM和0.3 nM
摘要
荧光RNA适配体有多种应用，包括用作成像RNA运输的荧光标签，以及作为基于RNA的传感器指示剂，在活细胞中结合小分子荧光团时发出荧光。目前的荧光RNA：荧光团复合物通常发出可见荧光。然而，开发具有近红外（NIR）荧光的荧光RNA用于体内成像和传感研究具有挑战性。为了解决这个问题，我们鉴定并调节了红色荧光蛋白样荧光团，使其结合Squash——一种高度折叠的荧光RNA。其中一种荧光团DFQL-1T在结合Squash时表现出光稳定的近红外荧光，能够在活哺乳动物细胞和小鼠中实现RNA可视化。利用Squash:DFQL-1T复合物，我们生成了基于RNA的传感器，用于检测活哺乳动物细胞和小鼠中的非编码RNA和小分子靶标。这些研究揭示了一种荧光RNA：荧光团复合物，可以很容易地开发成用于体内成像和传感的近红外荧光RNA标签。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否开发出具有近红外荧光的荧光RNA适配体：荧光团复合物，用于活细胞和活体小鼠中的RNA成像与传感？
- 核心机制
- Squash适配体可容纳C2位π共轭延伸的RFP样荧光团，N1位三氟乙基取代进一步红移发射并提高亮度，使DFQL-1T结合Squash后产生光稳定的近红外荧光；基于Squash的三向连接或变构传感器在靶标结合时诱导Squash折叠，从而激活DFQL-1T荧光。
- 主要证据
- 体外荧光光谱、量子产率和亲和力测定显示Squash:DFQL-1T发射654 nm且KD=56 nM；HEK293T细胞和小鼠移植模型中观察到近红外RNA信号；microRNA-21、piRNA-36026、四环素和SAM传感器在细胞及小鼠中均产生靶标依赖的荧光变化。
- 研究意义
- 提供了首个可用于体内传感的基于荧光RNA的近红外荧光平台，展示了荧光RNA作为体内成像剂的關鍵应用，为活体RNA成像和传感提供了新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
合成N1-三氟乙基衍生物并表征近红外荧光
进一步红移发射并提高亮度，获得近红外荧光团DFQL-1T。
合成DFHO-1T、DFAME-1T、DFIM-1T、DFQL-1T等衍生物，测量Squash:荧光团复合物的激发发射光谱、量子产率和消光系数。
在活细胞中验证Squash:DFQL-1T的近红外RNA成像
确定DFQL-1T能否在活哺乳动物细胞中点亮Squash并实现线性RNA成像。
在HEK293T细胞中表达环状Squash或Squash融合的U6、7SK线性RNA，加入DFQL-1T后进行共聚焦成像，并与SART3、SC35共定位验证。
评估Squash:DFQL-1T的光稳定性
比较DFQL-1T与DFHO结合Squash后的抗光漂白能力。
在体外和表达环状Squash的HEK293T细胞中连续照射，监测荧光衰减。
构建并优化基于Squash的近红外ncRNA传感器
设计三向连接传感器，检测microRNA-21和piRNA-36026。
将ncRNA反义序列插入三向连接的一个茎，Squash插入另一茎，筛选不同茎序列，并在MCF-7和LO2细胞中成像内源ncRNA。
构建并验证小分子近红外传感器
将Squash与四环素适配体或SAM-III核糖开关融合，实现小分子检测。
优化传感器结构域，在HEK293T细胞和小鼠移植模型中检测四环素和SAM，并用环亮氨酸抑制SAM合成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen | C11995500BT |
| TrypLE Express消化液 | Gibco | 25200056 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000008 |
| 细胞培养 | 24孔板 | Nest | 801006 |
| 体外RNA合成 | Taq DNA聚合酶 | Vazyme | P112 |
| PCR纯化试剂盒 | Axygen | AP-PCR-250 | |
| T7高产RNA转录试剂盒 | Vazyme | D4201 | |
| 活体成像 | IVIS Spectrum活体成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 双光子成像 | 无酚红DMEM | Biological Industries | 06-1052-04-1ACS |
| Nikon双光子正置显微镜 | Nikon | AX R MP | |
| 体外传感器表征 | 四环素 | BBI | A600504-0025 |
| S-腺苷甲硫氨酸 | Sigma-Aldrich | A7007 | |
| 选择性实验 | 新霉素 | Solarbio | N8090 |
| 妥布霉素 | Solarbio | T8810 | |
| 庆大霉素 | Solarbio | G8170 | |
| 卡那霉素 | Solarbio | K1030 | |
| S-腺苷同型半胱氨酸 | Aladdin | S139501 | |
| 腺苷 | Coolaber | CA1241 | |
| 甲硫氨酸 | Coolaber | CM7211 | |
| 实时定量PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| miRNA第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme Biotech Co., Ltd | MR101 | |
| Power SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | 4309155 | |
| LightCycler 480实时PCR系统 | Roche Applied Science | -- | |
| 细胞成像 | 共聚焦培养皿 | Nest Biotechnology | 806001 |
| 多聚-D-赖氨酸 | Sangon | E607014 | |
| 细菌成像 | M9基础培养基 | Gibco | A1374401 |
| 多聚-L-赖氨酸 | Sangon Biotech | A600751 | |
| 细胞成像 | 环亮氨酸 | Ark Pharm | AK-29341 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Squash:DFQL-1T复合物体外表征 | Squash RNA浓度10 μM、DFQL-1T浓度1 μM、缓冲液（40 mM HEPES pH 7.4, 100 mM KCl, 0.5 mM MgCl2）、37°C孵育1小时；KD测定使用Squash 50 nM 阅读提示：Methods中“Excitation and emission spectra measurement”和“Affinity measurements”小节 |
| 活细胞近红外成像 | HEK293T细胞表达环状Squash，DFQL-1T 2 μM或10 μM，成像前1小时换无酚红DMEM，激发514 nm/发射685±20 nm，曝光200-500 ms，37°C、5% CO2 阅读提示：Methods中“Microscopy and image processing”小节及图3d图注 |
| 小鼠活体成像 | BALB/c雌性6-8周龄，皮下移植1×10^8个细胞，移植后2小时原位注射DFQL-1T 10 μM，IVIS成像激发530±20 nm/发射660±20 nm，曝光1.0 s 阅读提示：Methods中“In vivo imaging and sensing”小节及图3f、图5f、图6e图注 |
| ncRNA传感器体外表征 | 传感器RNA 5 μM、DFQL-1T 10 μM、靶标RNA 10 μM，65°C 10分钟后0.5°C/30秒降温至25°C，激发516 nm/发射654 nm检测；检测限microRNA-21 0.2 nM、piRNA-36026 0.3 nM 阅读提示：Methods中“In vitro characterization of the Squash-based sensors”和“Sensitivity range and detection limit measurement”小节 |
| 小分子传感器细胞及体内验证 | 四环素100 μM或环亮氨酸30 mM处理1小时，DFQL-1T 10 μM孵育1小时；小鼠移植后2小时原位注射DFQL-1T 10 μM；SAM传感器检测限40 nM、四环素传感器5.4 nM 阅读提示：Methods中“Sensing of ncRNAs or small molecules”和“In vivo imaging and sensing”小节及图6图注 |