TDF传感器设计与组装表征
构建空间匹配circSCMH1的多价TDF传感器并验证其组装
设计边长37 bp（约12.6 nm）的三角形TDF，三条边各修饰荧光团/淬灭剂探针，通过热退火组装，琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜表征。
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用于环状RNA检测的快速灵敏多价空间模式识别
Fast and sensitive multivalent spatial pattern-recognition for circular RNA detection.
实验完整度
高体外细胞模型、动物模型和临床样本多层级验证，含特异性、动力学及功能机制验证
主要模型
HT-22小鼠海马神经元细胞系 HEK293T细胞系 光化学血栓性卒中雄性C57BL/6J小鼠模型 急性缺血性卒中患者血浆样本
重点核对
TDF传感器浓度100 nM，与circRNA孵育1分钟，Cy5荧光激发620 nm、发射640–800 nm TDF-37边长37 bp（约12.6 nm）为最优空间匹配，优于TDF-17、TDF-26和TDF-47 三探针位点TDF-37优于单探针TDF-1和双探针TDF-2，多价效应增强灵敏度 RNase R处理（20 U，37°C 30分钟）验证对环状形式的特异性 临床样本：29例健康对照和29例AIS患者血浆总RNA，无扩增直接检测
摘要
尽管环状RNA（circRNA）相比对应的线性RNA丰度较低，但它们展现出强大的生物学功能。然而，circRNA的低浓度和独特结构特征带来了挑战，使现有方法操作复杂且灵敏度较低。在此，我们设计了一种智能四面体DNA框架（TDF），具有精确的空间模式识别特性，对circRNA具有优异的传感速度和灵敏度。TDF传感器的信号输出仅在未扩增样本中对circRNA进行多价空间模式识别时发生。利用该传感器，我们可视化了体外神经元细胞和体内雄性小鼠卒中前后脑中内源性circRNA表达的实时响应，在临床样本中鉴定了急性缺血性卒中患者，并追踪了光化学卒中动物模型中circRNA的递送。因此，TDF传感器为生理和病理生理条件下circRNA丰度的检测提供了一种快速灵敏的工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何实现环状RNA在活细胞、活体动物及临床样本中的快速、灵敏、特异性检测与可视化追踪？
- 核心机制
- TDF传感器通过三角形DNA框架空间匹配circSCMH1三个靶序列（BSJ及两个剪接位点），以多价相互作用高效捕获circRNA，置换淬灭链恢复荧光信号。
- 主要证据
- 体外HEK293T和HT-22细胞中验证灵敏度（低至100 copies/nL）和特异性；活细胞实时成像监测circSCMH1动态；自由活动卒中小鼠双光子成像显示circSCMH1卒中后降低；脑切片原位成像优于传统探针；临床血浆样本检测与qPCR正相关；追踪EV递送的外源性circSCMH1。
- 研究意义
- TDF传感器为生理和病理生理条件下circRNA丰度检测提供快速灵敏工具，可用于临床诊断、卒中研究及核酸药物递送追踪。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TDF传感器灵敏度与特异性验证
评估TDF传感器对circSCMH1的检测灵敏度、特异性及动力学
HEK293T细胞转染circSCMH1质粒后提取总RNA，直接与TDF传感器孵育检测荧光；比较不同大小TDF和不同探针位点数目；测试对其他miRNA和circRNA的响应；RNase R处理验证环状特异性。
活细胞实时成像监测circSCMH1
验证TDF传感器在活细胞中实时监测circSCMH1表达动态的能力
HT-22细胞与TDF传感器孵育，活细胞成像系统实时监测荧光信号；2-DG处理模拟OGD条件观察circSCMH1变化；内吞抑制剂实验探究入胞机制；FRET验证胞内结构完整性。
自由活动卒中小鼠脑内circSCMH1双光子成像
在活体动物中实时追踪卒中前后circSCMH1的动态变化
小鼠植入颅窗，光化学血栓法制备卒中模型，尾静脉注射TDF传感器，使用小型化双光子显微镜在L2/3层皮层成像，追踪7天。
脑切片原位成像及与传统探针比较
评估TDF传感器在组织切片中原位检测circSCMH1的性能并与传统FISH探针比较
小鼠脑切片与TDF传感器孵育不同时间，共标记NeuN和GFAP，共聚焦成像；与传统生物素化探针FISH比较信号强度和操作时间；在光化学血栓卒中模型切片中检测circSCMH1变化。
临床样本中circSCMH1检测
验证TDF传感器在临床血浆样本中无扩增直接检测circRNA的可行性
提取29例健康对照和29例AIS患者血浆总RNA，与TDF传感器孵育后荧光检测，并与qPCR结果比较。
外源性circSCMH1体内追踪
验证TDF传感器追踪EV递送的外源性circSCMH1在体内分布的能力
EVs封装circSCMH1并用Dio或Dil标记膜，尾静脉或鼻内给药卒中小鼠，双光子显微镜和共聚焦显微镜成像追踪circSCMH1与EV共定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| TDF组装 | DNA Marker A（25–500 bp） | Sangon Biotech | -- |
| RNase R | Sangon Biotech | B110087 | |
| GelRed核酸凝胶染料 | Sangon Biotech | -- | |
| 琼脂糖 | Aladdin Reagent | -- | |
| 荧光检测 | Fluoromax-4荧光光谱仪 | Horiba Jobin Yvon | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| OGD处理 | 无糖无血清脱氧DMEM | Gibco | 11966-025 |
| 密封腔室 | Billups-Rothenburg | MIC-101 | |
| 水套式培养箱 | Thermo Fisher Scientific | Forma | |
| 2-DG处理 | 2-脱氧-D-葡萄糖 | sigma | D8375 |
| 活细胞成像 | 共聚焦显微镜 | Olympus | FV3000 |
| 光化学血栓模型 | 玫瑰红 | Sigma | 330,000 |
| 冷光源 | World Precision Instruments | -- | |
| 颅窗植入 | 组织粘合剂 | 3M | No1469SB |
| 双光子成像 | 小型化双光子显微镜 | Transcend Vivoscope Biotech Co., Ltd | TVS-FL-01 |
| 低熔点琼脂糖 | -- | -- | |
| qPCR | TRIzol试剂 | Takara | 9109 |
| HiScript Q RT SuperMix for qPCR试剂盒 | Vazyme | R123-01 | |
| SYBR Green qPCR预混液 | Vazyme | Q141-02 | |
| Applied Biosystems qPCR系统 | Thermo Fisher | StepOne | |
| 免疫荧光染色 | Dil染料 | Beyotime | C1036 |
| Triton X-100 | Aladdin | T109027 | |
| 正常山羊血清 | ZSGB-BIO | ZLI-9056 | |
| 抗NeuN抗体 | Abcam | ab177487 | |
| 抗GFAP抗体 | Sigma-Aldrich | G3893 | |
| Alexa 488标记山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 488标记山羊抗兔IgG | Invitrogen | A32731 | |
| Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG | Invitrogen | A-11012 | |
| Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A-11005 | |
| DAPI溶液 | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| FISH | 生物素化circSCMH1探针 | -- | -- |
| 链霉亲和素-FITC | Life Technology | 434311 | |
| 牛血清白蛋白 | Biosharp | BS043D | |
| EV标记 | Exo-spinTM缓冲液 | Cell Guidance System | EX03-8 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| XPN-100超速离心机 | Beckman Coulter | -- | |
| RIP | Magna RIPTM RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | 17-700 |
| 抗FTO抗体 | Invitrogen | MA5-33105 | |
| MeCP2抗体 | Sigma | SAB4800012 | |
| 活体成像 | IVIS Spectrum成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 内吞抑制剂实验 | 氯丙嗪 | -- | -- |
| 染料木黄酮 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TDF传感器组装与表征 | TDF边长37 bp（约12.6 nm）；11条寡核苷酸等摩尔混合；退火缓冲液含10 mM NaH2PO4/Na2HPO4 pH 7.0和50 mM MgCl2；95°C 10分钟后1分钟内冷却至4°C 阅读提示：Methods 'Preparation and characterization of TDFs'及Table S1；Fig. S2 |
| 荧光检测灵敏度与特异性 | TDF传感器浓度100 nM；反应体积200 μL；孵育1分钟室温；Cy5激发620 nm、发射640–800 nm；RNase R 20 U 37°C 30分钟 阅读提示：Methods 'Fluorescence Assay'和'RNase R treatment'；Fig. 1F–I、Fig. 2D–E |
| 活细胞实时成像 | HT-22细胞3×10^4接种；TDF传感器孵育3–24小时；活细胞工作站37°C、5% CO2；每5分钟拍照；2-DG 5 mM处理12小时 阅读提示：Methods 'CircSCMH1 dynamic imaging'和'2-Deoxy-D-glucose (2-DG) treatment'；Fig. 3 |
| 自由活动小鼠双光子成像 | 雄性C57BL/6J小鼠8–10周龄24.0–26.0 g；玫瑰红30 mg/kg静脉注射后光照5分钟诱导卒中；TDF传感器1 μM、100 μL尾静脉注射；注射后6小时检测；n=5只/组 阅读提示：Methods 'Photothrombotic (PT) stroke mouse model'和'Two-photon imaging in awake animals'；Fig. 4及Fig. S17 |
| 脑切片原位成像 | 切片厚度30 μm；TDF传感器孵育3、6、12小时；37°C最优；抗NeuN 1:200、抗GFAP 1:200；n=4只/组，每片10个细胞定量 阅读提示：Methods 'Immunofluorescence staining and confocal imaging'；Fig. 5及Fig. S19–S20 |
| 临床样本检测 | 29例健康对照和29例AIS患者血浆；外周血5 mL EDTA-K2抗凝；1000×g 4°C离心10分钟；总RNA直接与TDF传感器孵育；与qPCR比较 阅读提示：Methods 'Human plasma collection'和'Fluorescence Assay'；Fig. 6及Table S2 |
| 外源性circSCMH1体内追踪 | EVs蛋白浓度100 μg/mL；Dil 37°C标记15分钟；卒中后第3天尾静脉或鼻内给药；给药后4小时成像；n=3–6只/组 阅读提示：Methods 'EV staining and exogenous circSCMH1 labeling'；Fig. 7 |