高通量siRNA激酶组筛选
鉴定谷氨酰胺应激诱导巨胞饮的激酶调节因子
在AsPC-1细胞中使用siOTP-Dharmacon文库（靶向679个激酶）进行384孔板反向转染，谷氨酰胺饥饿联合2 mM DON诱导应激后，以FITC-dextran摄取和图像高内涵分析定量巨胞饮。
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细胞极性蛋白在代谢应激下促进巨胞饮
Cell polarity proteins promote macropinocytosis in response to metabolic stress.
实验完整度
高结合细胞系体外实验、siRNA高通量筛选、代谢示踪、小鼠异位移植瘤模型及153例PDAC患者组织芯片，含功能验证和机制验证。
主要模型
AsPC-1胰腺导管腺癌细胞系 HPAF-II胰腺导管腺癌细胞系 AsPC-1异位移植瘤裸鼠模型 PDAC患者组织芯片（153例手术切除标本）
重点核对
AsPC-1和HPAF-II细胞在无血清条件下谷氨酰胺饥饿（0 mM）24小时诱导巨胞饮，以2 mM谷氨酰胺为对照 siRNA敲低PKCζ（siPRKCZ#1/#2）、PKCι（siPRKCI#1/#2）或Par1a、Par3、Par6后检测FITC-dextran摄取，N=3独立实验 ACPD处理浓度与时长：AsPC-1 4 μM、HPAF-II 25 μM，处理72小时，每24小时更换抑制剂 DON处理浓度2 mM、24小时；EGF 100 nM处理10分钟；erlotinib 25 μM处理2小时 异位移植瘤：每侧皮下注射1×10^6个细胞，接种后10天给予多西环素（饮水2 mg/mL+5%蔗糖，饮食TD.01306），每组n=8个肿瘤
摘要
巨胞饮已成为癌细胞在营养缺乏的微环境中生存所利用的清除途径。肿瘤细胞尤其依赖谷氨酰胺生存，在胰腺导管腺癌（PDAC）细胞中，谷氨酰胺缺乏可增强巨胞饮的刺激。在此，我们鉴定非典型蛋白激酶C（aPKC）酶PKCζ和PKCι为巨胞饮的调节因子。在正常上皮细胞中，aPKC与支架蛋白Par3和Par6结合以调节细胞极性，影响包括Par1激酶在内的多个靶点，我们发现这些蛋白中的每一个都是巨胞饮所必需的。机制上，aPKC受EGFR信号或转录因子CREM调节，以促进Par3向微管重定位，从而以动力蛋白依赖的方式促进巨胞饮。重要的是，aPKC耗竭引起的细胞适应性损伤可通过恢复巨胞饮来挽救，并且aPKC在体内支持PDAC生长。我们的发现增进了对代谢应激背景下控制巨胞饮摄取机制基础的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在谷氨酰胺缺乏的代谢应激条件下，哪些调节因子控制胰腺导管腺癌细胞的巨胞饮，其机制如何？
- 核心机制
- 谷氨酰胺饥饿通过EGFR信号或DON通过转录因子CREM上调/激活aPKC（PKCζ和PKCι），aPKC促进Par3向微管重定位，并以动力蛋白依赖的方式促进巨胞饮；aPKC还调控Par1a T211磷酸化和Pak1激活。
- 主要证据
- 激酶组siRNA筛选及独立siRNA/ACPD验证aPKC调控巨胞饮；敲低Par1a/Par3/Par6、微管抑制剂和动力蛋白抑制剂均抑制巨胞饮；免疫荧光显示Par3依赖aPKC向微管 puncta 重定位；Pak1过表达可恢复PKCζ敲低细胞的巨胞饮和BSA支持的生长；异位移植瘤中aPKC敲低抑制肿瘤生长和瘤内巨胞饮。
- 研究意义
- 增进了对代谢应激背景下控制巨胞饮摄取机制基础的理解，并提示靶向细胞极性蛋白在癌症治疗中的可能性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
aPKC调控巨胞饮的验证
验证PKCζ和PKCι对谷氨酰胺应激诱导巨胞饮的必要性
用独立siRNA敲低PKCζ或PKCι（Western blot验证），并用aPKC药理抑制剂ACPD处理，在AsPC-1和HPAF-II细胞中检测谷氨酰胺饥饿条件下的FITC-dextran摄取。
细胞极性蛋白网络及微管/动力蛋白依赖性验证
检验Par1a、Par3、Par6以及微管网络和动力蛋白在谷氨酰胺应激诱导巨胞饮中的作用
敲低Par1a、Par3或Par6检测巨胞饮；用秋水仙碱或紫杉醇破坏微管网络、用Ciliobrevin D抑制动力蛋白后检测巨胞饮；免疫荧光检测Par3与微管/动力蛋白的亚细胞定位。
aPKC调控巨胞饮货物降解与代谢贡献检测
评估aPKC对巨胞饮货物溶酶体降解及蛋白来源氨基酸/代谢物生成的影响
DQ-BSA脉冲-追踪实验检测溶酶体降解；13C6-葡萄糖/13C5-谷氨酰胺标记结合GC/MS定量无标记非必需氨基酸和TCA循环中间产物；转铁蛋白摄取实验检测网格蛋白依赖内吞。
aPKC上游调控机制解析（EGFR与CREM）
解析谷氨酰胺饥饿和DON分别如何调控aPKC的激活与表达
Western blot检测aPKC总蛋白和T560/T555磷酸化；RT-qPCR检测mRNA；EGF刺激和erlotinib抑制实验；RNA-seq鉴定DON上调的转录因子；ChIP-qPCR检测CREM与PRKCZ启动子结合。
aPKC支持PDAC细胞适应性的功能验证
检验aPKC通过巨胞饮支持低谷氨酰胺条件下PDAC细胞增殖和生存
在低谷氨酰胺条件下检测PKCζ/PKCι敲低细胞的生长曲线及BSA挽救效果；过表达Pak1-WT或Pak1-T423E恢复巨胞饮和BSA支持的生长；检测cleaved PARP。
体内肿瘤生长与巨胞饮验证
验证aPKC在体内调控巨胞饮并支持PDAC肿瘤生长
构建多西环素诱导的shPRKCZ/shPRKCI AsPC-1稳定细胞系，皮下接种裸鼠，Dox诱导敲低后监测肿瘤生长；终点检测p-HistoneH3、cleaved caspase 3和离体TMR-dextran巨胞饮；免疫荧光检测p-PKCζT560在肿瘤周边与非周边的分布。
临床样本与公共数据集分析
评估aPKC和Par极性蛋白在PDAC患者中的表达及与预后的相关性
对153例手术切除PDAC组织芯片进行p-PKCζT560和总PKCζ免疫组化染色并评分；分析GSE数据集中的表达；利用TCGA数据评估总生存与PRKCI、PRKCZ、PARD3、PARD6B表达的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Corning | -- |
| DMEM培养基 | Corning | -- | |
| Tet系统认证胎牛血清 | Takara | 631101 | |
| 嘌呤霉素 | Sigma | P8833 | |
| PCR支原体检测试剂盒 | ABM | -- | |
| 药物处理 | 6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸 | Sigma | D1242 |
| 2-乙酰基-1,3-环戊二酮 | Sigma | R426911 | |
| 秋水仙碱 | Sigma | C9754 | |
| 紫杉醇 | Sigma | T7402 | |
| Ciliobrevin D | Sigma | 250401 | |
| 厄洛替尼 | Sigma | SML2156 | |
| 表皮生长因子 | Sigma | E9644 | |
| 星形孢菌素 | Tocris Biosciences | 1285 | |
| 多西环素 | Fisher | AC446060250 | |
| siRNA转染 | RNAimax转染试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 质粒转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 巨胞饮检测 | FITC-葡聚糖 | ThermoFisher Scientific | -- |
| DQ-BSA红色染料 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 转铁蛋白摄取 | 转铁蛋白 | VWR | 89427-102 |
| 13C示踪 | 13C6-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 13C5-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 牛血清白蛋白（V组分） | Millipore | -- | |
| L-正缬氨酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫印迹 | DC蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| PKCζ抗体 | CST | 9368S | |
| PKCι抗体 | BD Transduction Laboratories | 610175 | |
| 磷酸化PKCζT560抗体 | Abcam | ab62372 | |
| 磷酸化PKCιT555-63抗体 | Abcam | ab5813 | |
| Par3抗体 | Millipore Sigma | 07-330 | |
| CREM抗体 | Santa Cruz | sc-101530 | |
| ChIP-qPCR | CUTANA ChIC/CUT&RUN试剂盒 | EpiCypher | -- |
| CREM抗体 | Abnova | H00001390M02 | |
| RNA提取与qPCR | PureLink RNA小量提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SYBR Premix Taq II预混液 | Takara | -- | |
| RNA-seq | NEBNext Poly(A) mRNA磁分离模块 | NEB | -- |
| NEBNext Ultra II定向RNA文库构建试剂盒（Illumina） | NEB | -- | |
| 免疫荧光 | 微管蛋白抗体 | Sigma | T6074 |
| Par3抗体 | Sigma | HPA030443 | |
| 动力蛋白抗体 | ThermoFisher | MA1-070 | |
| MLC-2抗体 | CST | 8505S | |
| Acti-stain 488鬼笔环肽 | Cytoskeleton | PHDG1-A | |
| Alexa Fluor 488荧光二抗 | ThermoFisher Scientific | A32723 | |
| Alexa Fluor 594荧光二抗 | ThermoFisher Scientific | A11012 | |
| CK8抗体 | DSHB | TROMO-I | |
| 免疫组化 | 磷酸化组蛋白H3抗体 | CST | 9701 |
| cleaved caspase 3抗体 | CST | 9664 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP试剂盒 | Vector Labs | -- | |
| DAB HRP底物试剂盒 | Vector Labs | -- | |
| 细胞生长检测 | 结晶紫 | -- | -- |
| Syto60核酸染料 | ThermoFisher | S11342 | |
| 慢病毒转导 | Polybrene | MilliporeSigma | -- |
| 动物实验 | Matrigel基质胶 | Corning | -- |
| 多西环素饲料 | Envigo | TD.01306 | |
| 离体巨胞饮 | 10 kDa TMR-葡聚糖 | ThermoFisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与谷氨酰胺剥夺 | AsPC-1使用RPMI+10% FBS+20 mM HEPES+1 mM丙酮酸钠；HPAF-II使用DMEM+10% FBS+20 mM HEPES；谷氨酰胺饥饿为无血清0 mM 24小时，对照为2 mM谷氨酰胺 阅读提示：Methods“Cell culture and reagents”和“Glutamine deprivation”小节 |
| siRNA敲低与巨胞饮检测 | siRNA终浓度50 nM、连续两次转染；第二次转染后24小时无血清处理；FITC-dextran 1 mg/mL、37°C 30分钟；独立实验N=3 阅读提示：Methods“siRNA and plasmid transfection”和“In vitro macropinocytosis”小节及Fig. 1–3图注 |
| 药物处理条件 | DON 2 mM 24小时；ACPD AsPC-1 4 μM、HPAF-II 25 μM 72小时且每24小时更换；秋水仙碱100 ng/mL、紫杉醇200 nM 18小时；Ciliobrevin D 50 μM 30分钟；erlotinib 25 μM 2小时；EGF 100 nM 10分钟；Dox 2 μg/mL 3天 阅读提示：Methods“Cell culture and reagents”小节及对应图注 |
| 异位移植瘤体内实验 | 雌性Foxn1nu/Foxn1nu裸鼠6–7周龄；每侧皮下注射1×10^6个细胞（PBS:Matrigel 1:1）；接种后10天给予Dox（饮水2 mg/mL+5%蔗糖，饮食TD.01306）；接种后27–30天终止；生长曲线每组n=8个肿瘤 阅读提示：Methods“Animal studies”小节及Fig. 6图注 |
| 细胞生长与BSA挽救实验 | AsPC-1低谷氨酰胺0.1 mM、HPAF-II 0.05 mM；BSA 2%；Pak1挽救实验第12天检测；每组3重复、N=3–4独立实验 阅读提示：Methods“Cell growth assays”小节及Fig. 5图注 |
| 临床样本与数据集分析 | PDAC组织芯片153例手术切除标本（部分分析为152例）；p-PKCζT560和PKCζ抗体浓度1:400；生存分析使用TCGA Mixed pancreatic adenocarcinoma数据集，cut_off modus=scan、最小分组8 阅读提示：Methods“Clinical data analysis”小节及Fig. 7图注 |