糖尿病状态下OSGEP表达分析
探究OSGEP表达是否与糖尿病相关。
分析人类胰岛转录组数据集（GSE76896、E-MTAB-5061、GSE86473）以及db/db和HFD小鼠胰岛中Osgep的mRNA和蛋白水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
OSGEP通过调节胰岛素原翻译和维持内质网应激稳态调控小鼠胰岛β细胞功能
OSGEP regulates islet β-cell function by modulating proinsulin translation and maintaining ER stress homeostasis in mice.
实验完整度
高包含全局和β细胞特异性敲除小鼠、AAV过表达小鼠、体外细胞实验及人类遗传关联分析，具备功能与机制验证。
主要模型
Osgep全局敲除小鼠（Osgep-Ubc-CreERT） 胰岛β细胞特异性Osgep敲除小鼠（Osgep-Ins2-Cre） AAV2/Pan介导的胰腺Osgep过表达小鼠 Min6细胞系
重点核对
小鼠模型：Osgep-Ins2-Cre与WT同窝对照，在CD或HFD喂养条件下 胰岛素活性检测：从胰腺提取胰岛素，以相同浓度注射至禁食小鼠，比较降糖能力 t6A37水平：HPLC-MS/MS检测胰岛tRNA中t6A37与A的比值 胰岛素原翻译保真性：体外兔网状红细胞裂解系统中加入不同来源tRNA，Western blot检测胰岛素原产物 人类遗传关联：rs74512655基因型与T2DM风险的关联，在发现队列和验证队列中分析
摘要
胰岛素原的翻译和折叠对葡萄糖稳态至关重要。然而，胰岛β细胞对胰岛素原翻译的控制仍不完全清楚。在这里，我们鉴定出OSGEP，一种负责tRNANNU的t6A37修饰的酶，可调节β细胞中的葡萄糖代谢。全局敲除Osgep会导致葡萄糖不耐受，而β细胞特异性敲除则因胰岛素活性受损而引起高血糖和葡萄糖不耐受。转录组学和蛋白质组学揭示，Osgep缺陷的胰岛中未折叠蛋白反应（UPR）和凋亡信号通路被激活，这与t6A37修饰减少导致的错误折叠胰岛素原增加有关。在胰腺中过表达Osgep可挽救高脂饮食小鼠的胰岛素分泌并减轻糖尿病。Osgep增强翻译保真度并缓解UPR信号，突显其作为糖尿病治疗靶点的潜力。携带rs74512655位点C等位基因（该等位基因促进OSGEP转录）的个体可能对T2DM易感性降低。这些发现表明OSGEP对胰岛β细胞至关重要，并可能是糖尿病治疗的潜在靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- OSGEP在胰岛β细胞中如何调控胰岛素原翻译和葡萄糖稳态，以及其与2型糖尿病易感性的关系。
- 核心机制
- OSGEP作为t6A37修饰酶，通过维持tRNANNU的t6A37水平保障胰岛素原翻译保真度和效率，减少错误折叠胰岛素原积累，从而缓解内质网应激和UPR信号；其缺失导致翻译错误、胰岛素原氧化折叠受损、UPR激活和β细胞凋亡。
- 主要证据
- 在Osgep-Ins2-Cre小鼠中观察到葡萄糖不耐受、胰岛素活性降低、t6A37水平下降约60%、错误折叠胰岛素原增加、UPR通路激活和β细胞凋亡；AAV介导的胰腺Osgep过表达改善HFD小鼠的糖耐量和胰岛素分泌；rs74512655 C等位基因与T2DM风险降低相关，并增强OSGEP启动子活性。
- 研究意义
- OSGEP是维持胰岛β细胞功能的关键因子，其上调可能成为改善UPR依赖性糖尿病的潜在治疗策略；rs74512655可能作为T2DM易感性的遗传标记。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
全局Osgep敲除小鼠的葡萄糖代谢表型
验证Osgep是否调控血糖稳态。
构建他莫昔芬诱导的全局Osgep敲除小鼠，进行IPGTT和胰岛素耐量试验。
胰岛β细胞特异性Osgep敲除小鼠的代谢表型
明确Osgep在胰岛β细胞中的生理功能。
将Osgep-floxed小鼠与Ins2-Cre小鼠杂交，获得β细胞特异性敲除小鼠，监测体重、血糖、IPGTT、ITT、胰岛素分泌和胰岛形态。
HFD喂养下β细胞特异性Osgep敲除小鼠的代谢表型
探究代谢应激下Osgep缺失对β细胞功能的影响。
对WT和Osgep-Ins2-Cre小鼠进行16周HFD喂养，检测体重、血糖、IPGTT、ITT、胰岛素分泌、胰岛形态和超微结构。
胰岛素活性检测
验证Osgep缺失是否影响胰岛素降糖活性。
从胰腺提取胰岛素，注射至禁食小鼠，监测血糖变化。
t6A37修饰水平检测
验证Osgep缺失是否降低tRNA的t6A37修饰。
分离胰岛tRNA，酶解为核苷，HPLC-MS/MS检测t6A与A的比值。
胰岛素原翻译保真性和效率验证
验证t6A37修饰缺陷是否直接影响胰岛素原翻译。
体外转录翻译系统，加入不同来源tRNA，Western blot检测胰岛素原产物；非还原性Western blot分析胰岛素原氧化折叠。
转录组和蛋白质组分析
探究Osgep缺失影响的信号通路。
对12周龄雄性WT和Osgep-Ins2-Cre小鼠胰岛进行RNA-seq和TMT蛋白质组学分析，GSEA和KEGG富集分析。
内质网应激和UPR信号验证
验证Osgep缺失是否引起内质网应激和UPR激活。
电镜观察ER超微结构，Western blot和qPCR检测UPR标志物；使用Tm和Tg诱导内质网应激模型；PI染色检测细胞凋亡。
AAV介导的胰腺Osgep过表达 rescue实验
验证Osgep过表达能否改善糖尿病表型。
9周龄C57BL/6J小鼠注射AAV2/Pan-CMV-Osgep或对照病毒，在CD或HFD条件下监测代谢指标和UPR标志物。
rs74512655与T2DM关联及功能验证
探究OSGEP SNP与T2DM易感性的关系及其对转录活性的影响。
在发现队列和验证队列中基因分型，双荧光素酶报告基因检测rs74512655 G/C等位基因对启动子活性的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| IPGTT | D-葡萄糖 | Solarbio | -- |
| 血糖仪 | Roche | AUUC-CHEK | |
| ITT | 胰岛素 | Beyotime | -- |
| 血清胰岛素检测 | 小鼠胰岛素ELISA试剂盒 | Mercodia | 10-1247-01 |
| 血清胰高血糖素检测 | 胰高血糖素ELISA试剂盒 | Zcibio | ZC-38937 |
| 胰岛分离 | V型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C9263 |
| 双硫腙 | Solarbio | -- | |
| 免疫荧光 | 抗胰岛素抗体 | Proteintech | 15848-1-AP |
| 抗胰高血糖素抗体 | Proteintech | 15954-1-AP | |
| Osgep抗体 | SANTA CRUZ | sc-393199 | |
| CoraLite488标记驴抗兔IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-6 | |
| CoraLite594标记山羊抗小鼠IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-3 | |
| Western blot | Osgep抗体 | SANTA CRUZ | sc-393199 |
| β-微管蛋白抗体 | Proteintech | 10094-1-AP | |
| 胰岛素抗体 | Proteintech | 66198-1-Ig | |
| 胰岛素原抗体 | Novus | NB100-73013 | |
| IRE1α抗体 | Cell Signaling Technology | 3294 | |
| Bip抗体 | Proteintech | 66574-1-Ig | |
| PERK抗体 | Sigma | P0074 | |
| 磷酸化PERK抗体 | Sigma | SAB5700521 | |
| eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 5324 | |
| 磷酸化eIF2α抗体 | Cell Signaling Technology | 3398 | |
| ATF4抗体 | Cell Signaling Technology | 11815 | |
| CHOP抗体 | Cell Signaling Technology | 2895 | |
| ATF6抗体 | Proteintech | 66563-1-Ig | |
| AKT抗体 | Proteintech | 60203-2-Ig | |
| 磷酸化Akt1/2/3抗体 | SANTA CRUZ | SC-514032 | |
| Gapdh抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 山羊抗兔HRP抗体 | Sigma | A0545 | |
| 山羊抗小鼠HRP抗体 | Sigma | A6154 | |
| t6A37检测 | 蛇毒磷酸二酯酶 | Sigma | -- |
| 核酸酶P1 | Sigma | -- | |
| 碱性磷酸酶 | Sigma | -- | |
| ExionLC AD仪器 | AB SCIEX | -- | |
| Discovery C18色谱柱 | Waters | -- | |
| Triple Quad 6,500质谱仪 | AB SCIEX | -- | |
| 圆二色光谱 | MOS-500圆二色光谱仪 | Bio-Logic Science Instruments | -- |
| 体外转录 | T7高产帽RNA转录试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| 体外翻译 | Flexi®兔网状红细胞裂解物系统 | Promega | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Takara | -- |
| RT-qPCR | Prime Script RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | -- |
| 2×SYBR Green qPCR预混液 | Bimake.cn | -- | |
| QuantStudio 5实时PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| β-巯基乙醇 | -- | -- | |
| 慢病毒包装 | Hek293T细胞 | Takara Bio | 632180 |
| 慢病毒感染 | 聚brene | -- | -- |
| 慢病毒筛选 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 细胞凋亡检测 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| Hoechst染料 | -- | -- | |
| 内质网应激诱导 | 衣霉素 | -- | -- |
| 毒胡萝卜素 | -- | -- | |
| AAV注射 | AAV2/Pan-CMV-Osgep-EF1-GdGreen-WPRE病毒 | OBiO Technology | -- |
| AAV2/Pan-CMV-MCS-EF1-GdGreen-WPRE对照病毒 | OBiO Technology | -- | |
| DNA提取 | Wizard®基因组DNA纯化试剂盒 | Promega | -- |
| 基因分型 | Sequenom MassARRAY系统 | -- | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测 | pGL3载体 | Promega | -- |
| 快速定点突变系统 | TransGen Biotech | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| phRG-TK海肾荧光素酶内参质粒 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与喂养 | 小鼠品系C57BL/6J，Osgep-floxed与Ins2-Cre杂交，HFD喂养16周，CD对照 阅读提示：Methods 'Animal studies'及Figure legends 2、3 |
| IPGTT | 过夜禁食，腹腔注射2 g/kg 20% D-葡萄糖，检测时间点0、15、30、60、120分钟 阅读提示：Methods 'Intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT)' |
| 胰岛素活性检测 | 胰腺胰岛素提取方法，注射剂量，禁食时间6小时，阳性对照胰岛素标准品 阅读提示：Methods 'Mice insulin purification'及Figure 4a-c |
| t6A37水平检测 | tRNA纯化方法，酶解条件，HPLC-MS/MS参数，t6A/A比值计算 阅读提示：Methods 'Analysis of t6A37 modification of tRNA' |
| AAV介导的基因过表达 | AAV血清型AAV2/Pan，剂量5×10^11 v.g./只，注射时间9周龄，注射方式腹腔 阅读提示：Methods 'Adenoviral vector construction and infection'及Figure 7a |
| rs74512655关联分析 | 发现队列234 T2DM/285对照，验证队列228 T2DM/228对照，协变量调整（年龄、性别） 阅读提示：Methods 'Human subjects'及'OSGEP SNP Genotyping'，Table 1和2 |