构建rRNA修饰检测与抗生素耐药性关联模型
验证rsmG和rsmA敲除株分别对链霉素和春雷霉素的耐药性，并确认纳米孔测序可检测相关rRNA修饰。
培养大肠杆菌野生型及rsmG、rsmA、rsmF敲除株，测定生长曲线；提取总RNA进行直接RNA纳米孔测序，使用EpiNano-Error比较敲除株与野生型的碱基识别错误。
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Native RNA nanopore sequencing reveals antibiotic-induced loss of rRNA modifications in the A- and P-sites.
Native RNA nanopore sequencing reveals antibiotic-induced loss of rRNA modifications in the A- and P-sites.
实验完整度
高包含体外大肠杆菌培养、多种敲除株、小鼠模型、纳米孔测序及多种功能验证
主要模型
大肠杆菌BW25113野生型及rsmA、rsmG、rsmF等敲除株 小鼠Nsun5敲除模型
重点核对
大肠杆菌野生型及rsmA、rsmG、rsmF敲除株的纳米孔直接RNA测序 抗生素处理浓度：链霉素16 μg/mL，春雷霉素250 μg/mL 抗生素处理时间：1 h或16 h NanoConsensus阈值：Z-score > 5，NanoConsensus score > 5倍转录本中位数 小鼠Nsun5敲除验证：RT-qPCR和亚硫酸氢盐测序
摘要
mRNA修饰的生物学相关性和动态已被广泛研究；然而，rRNA修饰是否受到动态调控以及在何种条件下受到调控仍不清楚。在此，我们使用天然RNA纳米孔测序系统表征了细菌在暴露于多种抗生素后的rRNA修饰。为了识别显著的rRNA修饰变化，我们开发了NanoConsensus，这是一种新颖的分析流程，对RNA修饰类型、化学计量和覆盖度均具有稳健性，假阳性率极低，优于所有测试的单一算法。随后我们应用NanoConsensus表征抗生素暴露后的rRNA修饰景观，发现rRNA修饰谱在核糖体A位点和P位点附近以抗生素特异性方式发生改变，可能有助于抗生素耐药性。我们的工作表明，rRNA修饰谱可以响应环境暴露而快速改变，并提供了一种稳健的工作流程，可以以可扩展和可重复的方式研究任何物种中的rRNA修饰动态。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细菌rRNA修饰是否能在抗生素暴露下发生动态改变，以及这种改变是否与抗生素耐药性相关。
- 核心机制
- 抗生素暴露导致核糖体A位点和P位点附近特定rRNA修饰位点的修饰水平降低，这种丢失源于新合成的低修饰rRNA分子的出现，而非rRNA序列突变或操纵子使用改变。
- 主要证据
- 利用纳米孔直接RNA测序和NanoConsensus流程分析链霉素或春雷霉素处理的大肠杆菌，发现16S rRNA上多个修饰位点（包括m7G527和m6,6A1518/1519）修饰水平显著下降；Nano3P-seq和差异表达分析显示链霉素处理上调核糖体合成基因，单分子分析显示抗生素处理后出现低修饰rRNA reads。
- 研究意义
- 揭示了rRNA修饰可被环境暴露动态调控，为研究rRNA修饰动态提供了稳健的工作流程，并提示rRNA修饰失调可能是细菌增加对抗生素耐受性的常见分子机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基准测试RNA修饰检测算法并开发NanoConsensus
评估不同算法在多种RNA修饰类型、化学计量和覆盖度下的性能，并开发更稳健的共识流程。
使用已知修饰位点的大肠杆菌和酿酒酵母野生型/敲除株数据集，对EpiNano、Nanopolish、Tombo和Nanocompore进行基准测试；开发NanoConsensus整合四种算法输出，通过Z-score归一化和5-mer重叠识别差异修饰位点。
分析抗生素暴露后的rRNA修饰动态
探究链霉素或春雷霉素处理是否改变大肠杆菌rRNA修饰谱。
大肠杆菌培养至对数早期，分别用链霉素或春雷霉素处理1 h或16 h，提取总RNA进行直接RNA纳米孔测序，使用NanoConsensus比较处理与未处理样本的rRNA修饰差异。
排除rRNA序列突变和操纵子使用差异的干扰
验证观察到的差异修饰信号并非由rRNA基因突变或替代操纵子使用引起。
对7个大肠杆菌rRNA操纵子的16S rRNA序列进行多序列比对；使用Nano3P-seq对处理与未处理样本的rRNA进行测序，检测突变。
探究低修饰rRNA分子的来源
确定抗生素暴露后出现的低修饰rRNA分子是否源于新转录。
使用Nano3P-seq进行核糖体 depleted RNA测序和差异表达分析；计算单read碱基识别错误累积分布，比较处理与未处理样本中低修饰reads的比例。
评估其他甲基转移酶敲除株的抗生素耐药性
检验除rsmA和rsmG外，其他负责差异修饰位点的甲基转移酶缺失是否导致耐药性。
培养7种大肠杆菌甲基转移酶敲除株（包括rsmA、rsmG等），在系列抗生素浓度下测定生长曲线，计算AUC差异。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗生素处理 | 链霉素 | Sigma-Aldrich | S6501-5G |
| 春雷霉素 | Merck | 32354-100MG | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Life Technologies | 15596018 |
| 氯仿 | Vidra Foc | C2432 | |
| RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| Turbo DNA酶 | Life Technologies | AM2239 | |
| RNeasy MinElute试剂盒 | Qiagen | 74204 | |
| 直接RNA纳米孔测序文库构建 | 大肠杆菌Poly(A)聚合酶 | New England Biolabs | M0276L |
| 直接RNA测序试剂盒 | Oxford Nanopore Technologies | SQK-RNA002 | |
| SuperScript IV逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | |
| Maxima酶 | Life Technologies | EP0751 | |
| 核糖体RNA去除 | riboPOOL寡核苷酸 | siTOOLs | 055 |
| SUPERase•In RNase抑制剂 | Thermo Fisher | AM2694 | |
| Dynabeads MyOne链霉亲和素C1磁珠 | Thermo Fisher | 65001 | |
| RNA Clean & Concentrator-5试剂盒 | Zymo | R1013 | |
| Nano3P-seq | RNasin核糖核酸酶抑制剂 | Promega | N2511 |
| TGIRT逆转录酶 | InGex | -- | |
| dNTP混合物 | NEB | N0447S | |
| RNA酶混合物 | Thermo Scientific | AM2286 | |
| AMPure XP磁珠 | Agencourt | A63881 | |
| 平末端/TA连接酶混合物 | NEB | M0367S | |
| Qubit单链DNA高灵敏度检测试剂盒 | Thermo Scientific | Q10212 | |
| 5X NEB快速连接缓冲液 | NEB | B6058S | |
| 快速T4 DNA连接酶 | NEB | M0202M | |
| 直接cDNA纳米孔测序试剂盒 | ONT | SQK-DCS109 | |
| 小鼠基因型鉴定 | TaqMan探针Mm00520549_m1 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| TaqMan探针Mm99999915_g1 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 小鼠RNA提取 | QIAzol裂解试剂 | Qiagen | -- |
| TURBO DNA酶I | Invitrogen | -- | |
| 亚硫酸氢盐转化 | Methylamp RNA亚硫酸氢盐转化试剂盒 | Epigentek | -- |
| Maxima H-minus cDNA合成预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| pCR 2.1 TOPO载体 | Invitrogen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌培养与抗生素处理 | 大肠杆菌BW25113株；起始OD600≈0.01；培养至OD600≈0.4；链霉素终浓度16 μg/mL；春雷霉素终浓度250 μg/mL；处理时间1 h或16 h；生物学三重复 阅读提示：Methods 'Bacterial exposure to antibiotics' |
| 直接RNA纳米孔测序 | 总RNA 600 ng；poly(A)加尾10 min at 37 °C；使用SQK-RNA002试剂盒；SuperScript IV或Maxima酶线性化 阅读提示：Methods 'Direct RNA nanopore library preparation and sequencing' |
| NanoConsensus分析 | 仅保留全长reads；16S rRNA覆盖至少50-1525位；23S rRNA覆盖至少50-2894位；NanoConsensus参数--MZS_thr 3.75 --NC_thr 4；Z-score阈值默认5 阅读提示：Methods 'Detection of RNA modifications from bacterial samples exposed to antibiotics' 和 'Prediction of RNA modifications using NanoConsensus' |
| 生长曲线实验 | 初始OD600 0.01；链霉素浓度8、16、32、64、128 μg/mL；春雷霉素浓度62、125、250、500、1000 μg/mL；37 °C；每10 min测定OD600；生物学四重复 阅读提示：Methods 'Growth curves of bacterial strains lacking individual methyltransferases' 和 'Growth curves of antibiotic-resistant E. coli strains' |
| Nano3P-seq | 核糖体 depleted总RNA 50 ng；TGIRT逆转录；使用SQK-DCS109试剂盒；生物学三重复 阅读提示：Methods 'End-capture nanopore cDNA sequencing (Nano3P-seq)' |