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        两种机制抑制cyclin B1翻译以维持小鼠卵母细胞的前期阻滞

        Two mechanisms repress cyclin B1 translation to maintain prophase arrest in mouse oocytes.

        作者信息Shiya Cheng, Melina Schuh
        PMID39567493
        期刊Nat Commun
        发布时间2024-11
        DOI10.1038/s41467-024-54161-w
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        使用Trim-Away急性耗竭、RIBOmap翻译检测、荧光报告mRNA、活细胞成像等多层功能与机制验证。

        主要模型

        小鼠全生长卵母细胞（GV期） 小鼠卵泡培养体系 mClover3-Ccnb1 3’UTR报告mRNA

        重点核对

        Trim-Away中Trim21 mRNA注射浓度0.5 μM或1 μM，抗体注射浓度2 mg/ml dbcAMP 250 μM或RO-3306 10 μM维持前期阻滞 RIBOmap检测翻译中固定、杂交、连接、扩增条件 报告mRNA注射量4 pl（1 μM）或0.2 μM报告mRNA与0.1 μM mScarlet共注射 统计基于至少两个独立实验，样本量以卵母细胞数表示

        摘要

        在哺乳动物中，卵母细胞在减数第一次分裂前期长期停滞。前期阻滞对生殖至关重要，因为它允许卵母细胞生长到完整大小以支持减数分裂成熟和胚胎发育。前期阻滞需要抑制性磷酸化有丝分裂激酶CDK1。前期阻滞是否也在翻译水平受到调控尚不清楚。在这里，我们展示前期阻滞受休眠cyclin B1 mRNA的翻译控制调控。使用Trim-Away，我们鉴定出两种维持cyclin B1休眠并因此维持前期阻滞的机制。第一，RNA结合蛋白DDX6、LSM14B和CPEB1的复合物通过与其3’UTR相互作用直接抑制cyclin B1翻译。第二，细胞质多聚(A)结合蛋白（PABPCs）通过将翻译机器隔离在长尾mRNA上，间接抑制cyclin B1和其他无poly(A)尾或短尾mRNA的翻译。总之，我们展示了RNA结合蛋白如何协同调控前期阻滞，并揭示了PABPCs在控制mRNA休眠中的意外作用。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        前期阻滞是否在翻译水平受到调控，以及哪些RNA结合蛋白参与该调控。
        核心机制
        DDX6/LSM14B/CPEB1复合物通过结合cyclin B1 mRNA 3’UTR直接抑制其翻译；PABPCs通过将翻译机器隔离在长尾mRNA上间接抑制无尾或短尾mRNA（包括cyclin B1）的翻译。
        主要证据
        Trim-Away急性耗竭DDX6/LSM14B或PABPCs导致cyclin B1翻译增加和前期阻滞提前恢复；RIBOmap显示翻译性cyclin B1 mRNA增加；报告mRNA实验证明依赖短poly(A)尾；tdPCP-PP7招募实验显示PABPCs与DDX6/LSM14B数量依赖性拮抗。
        研究意义
        揭示RNA结合蛋白协同调控前期阻滞的机制，并发现PABPCs在控制mRNA休眠中的新作用。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        急性耗竭DDX6/LSM14B并观察减数分裂恢复

        验证DDX6和LSM14B是否维持前期阻滞。

        向小鼠全生长卵母细胞注射Trim21 mRNA和DDX6抗体进行Trim-Away，在dbcAMP存在下培养，通过Western blot、免疫荧光和时间延时成像检测蛋白耗竭及减数分裂恢复。

        2

        检测cyclin B1翻译与蛋白积累

        验证DDX6/LSM14B是否抑制cyclin B1翻译。

        Trim-Away后使用Western blot检测cyclin B1蛋白，使用改良RIBOmap检测翻译中的cyclin B1 mRNA，并使用RT-qPCR检测总mRNA水平。

        3

        验证cyclin B1翻译增加导致减数分裂恢复

        检验cyclin B1翻译增加是否是减数分裂提前恢复的原因。

        注射外源cyclin B1 mRNA或在Trim-Away前进行Ccnb1 RNAi，并在dbcAMP存在下评估减数分裂恢复；使用RO-3306处理检测CDK1抑制对恢复的影响。

        4

        检测CPEB1在复合物中的作用

        验证CPEB1是否介导DDX6/LSM14B对cyclin B1翻译的抑制。

        使用Trim-Away耗竭CPEB1，Western blot检测蛋白，RIBOmap检测cyclin B1翻译，并在dbcAMP存在下评估减数分裂恢复。

        5

        分析poly(A)尾长度及报告mRNA翻译

        检验cyclin B1翻译抑制是否依赖poly(A)尾。

        使用Poly(A) Tail-Length Assay Kit检测cyclin B1 poly(A)尾长度；注射含不同poly(A)尾的mClover3-Ccnb1 3’UTR报告mRNA与mScarlet对照，检测荧光比值。

        6

        急性耗竭PABPCs并检测翻译和减数分裂

        验证PABPCs对cyclin B1翻译和前期阻滞的影响。

        使用Trim-Away单独或同时耗竭PABPC1L和PABPC4，RIBOmap检测cyclin B1翻译，Western blot检测蛋白，并在dbcAMP存在下评估减数分裂恢复。

        7

        检测不同poly(A)尾长度mRNA的翻译

        揭示PABPCs对长尾和短尾/无尾mRNA翻译的差异调控。

        注射mClover3-A0、mClover3-A34或mClover3->A150报告mRNA，检测荧光强度；使用RIBOmap检测内源性Orc6、Btg4、Tcl1b4、Sec61g、Tbca和Actb翻译。

        8

        tdPCP-PP7招募实验分析PABPCs与DDX6/LSM14B拮抗

        系统研究PABPCs和DDX6/LSM14B在同一mRNA上的数量关系。

        构建含不同PP7拷贝数和不同poly(A)尾长度的mClover3报告mRNA，与tdPCP、tdPCP-Ddx6或tdPCP-Lsm14b mRNA共注射，检测mClover3/mScarlet荧光比值。

        9

        活细胞成像分析减数分裂成熟

        比较DDX6/LSM14B与PABPCs耗竭对减数分裂成熟的影响。

        注射mClover3-Map4-MTBD和H2B-mRFP mRNA标记纺锤体和染色体，进行时间延时成像，分析NEBD、染色体分离、纺锤体形态和染色体排列。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        免疫荧光蛋白质印迹逆转录定量PCR
        验证细胞功能变化
        时间延时活细胞成像Trim-Away急性蛋白降解RNA干扰
        验证分子表达变化
        改良RIBOmappoly(A)尾长度检测荧光报告mRNA检测
        验证机制链路
        tdPCP-PP7招募实验
        数据分析与统计
        单因素方差分析及Tukey事后检验双因素方差分析及Tukey事后检验非配对双尾Student t检验双尾Fisher精确检验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        卵母细胞培养二丁酰环腺苷酸----
        RO-3306----
        M2培养基homemade--
        卵泡培养含GlutaMAX的MEM培养基Thermo Fisher Scientific42360024
        胎牛血清Thermo Fisher Scientific16000044
        含核苷和GlutaMAX的MEM α培养基Thermo Fisher Scientific32571028
        绵羊促卵泡激素National Hormone and Peptide ProgramNIDKK-oFSH-20
        胶原包被插入式培养皿Corning3491/3493
        免疫荧光Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
        小鼠抗DDX6抗体Sigma-AldrichSAB4200837
        兔抗LSM14B抗体Thermo Fisher ScientificPA5-66371
        兔抗4E-T抗体Thermo Fisher ScientificPA5-51680
        兔抗YBX2抗体Abcamab33164
        豚鼠抗ZAR1抗体Cambridge Research Biochemicals--
        Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgGThermo Fisher Scientific--
        Alexa Fluor 568标记山羊抗兔IgGThermo Fisher Scientific--
        Alexa Fluor 647标记山羊抗豚鼠IgGThermo Fisher Scientific--
        RIBOmap牛血清白蛋白Thermo Fisher ScientificAM2616
        SUPERase•In RNA酶抑制剂Thermo Fisher ScientificAM2696
        酵母tRNAThermo Fisher ScientificAM7119
        T4 DNA连接酶Thermo Fisher ScientificEL0012
        Phi29 DNA聚合酶NEBM0269S
        脱氧核苷三磷酸Thermo Fisher Scientific18427013
        mRNA合成HiScribe T7 ARCA mRNA合成试剂盒NEBE2060S
        mRNA纯化RNeasy Mini试剂盒Qiagen74104
        RNA干扰Ccnb1 siRNA 1Thermo Fisher Scientifics114071
        Ccnb1 siRNA 2Thermo Fisher Scientifics114072
        对照siRNAThermo Fisher Scientific4390843
        Pabpc1 siRNA 1Thermo Fisher Scientifics71211
        Pabpc1 siRNA 2Thermo Fisher Scientifics71213
        Pabpc4 siRNA 1Thermo Fisher Scientifics106566
        Pabpc4 siRNA 2Thermo Fisher Scientifics106567
        Trim-Away超滤Merck MilliporeUFC505024
        对照IgGMerck Millipore12-370, 12-371
        小鼠抗DDX6抗体Sigma-AldrichSAB4200837
        兔抗DDX6抗体Thermo Fisher ScientificA300-461A
        兔抗CPEB1抗体Proteintech13274-1-AP
        小鼠抗PABPC1L抗体Santa Cruz Biotechnologysc-515476L
        兔抗PABPC4抗体Thermo Fisher ScientificPA5-96483
        活细胞成像5-SiR-Hoechst----
        玻璃底培养皿MatTekP35G-1.0-14-C
        四腔35 mm培养皿Greiner Bio-One627871
        LSM 880共聚焦激光扫描显微镜Zeiss--
        免疫印迹NuPAGE LDS上样缓冲液Thermo Fisher ScientificNP0007
        NuPAGE 10% Bis-Tris蛋白凝胶Thermo Fisher ScientificNP0301BOX
        NuPAGE MOPS SDS电泳缓冲液Thermo Fisher ScientificNP0001
        PVDF膜Thermo Fisher ScientificLC2005
        NuPAGE转膜缓冲液Thermo Fisher ScientificNP0006
        兔抗DDX6抗体Abcamab174277
        兔抗LSM14B抗体Thermo Fisher ScientificPA5-66371
        兔抗4E-T抗体Thermo Fisher ScientificPA5-51680
        兔抗DDB1抗体Abcamab109027
        小鼠抗cyclin B1抗体Santa Cruz Biotechnologysc-245
        兔抗MOS抗体Santa Cruz Biotechnologysc-1093-R
        小鼠抗CDK1抗体Thermo Fisher ScientificMA5-11472
        兔抗磷酸化CDK1(Tyr15)抗体Cell Signaling Technology9111
        兔抗CPEB1抗体Proteintech13274-1-AP
        小鼠抗PABPC1L抗体Santa Cruz Biotechnologysc-515476
        兔抗PABPC1抗体Proteintech10970-1-AP
        兔抗PABPC4抗体Thermo Fisher ScientificPA5-96483
        HRP标记山羊抗小鼠IgGAbcamab205719
        HRP标记山羊抗兔IgGAbcamab205718
        SuperSignal West Femto最高灵敏度底物Thermo Fisher Scientific34095
        Amersham Imager 600成像仪Cytiva--
        RT-qPCRRNeasy Micro试剂盒Qiagen74004
        SuperScript IV第一链合成系统Thermo Fisher Scientific18091050
        PowerUp SYBR Green预混液Thermo Fisher ScientificA25742
        Rotor-Gene Q系统Qiagen--
        poly(A)尾长度检测poly(A)尾长度检测试剂盒Thermo Fisher Scientific76450

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        卵母细胞分离与培养
        小鼠品系（C57BL/6 N和CD1）、年龄（7-10周）、dbcAMP浓度（250 μM）、培养基（无酚红M2）
        阅读提示：Methods 'Preparation and culture of mouse oocytes and follicles'
        Trim-Away
        Trim21 mRNA浓度（0.5 μM或1 μM）、抗体浓度（2 mg/ml）、注射体积（2 pl）、NP-40浓度（0.1%）、RO-3306浓度（10 μM）
        阅读提示：Methods 'Trim-Away in mouse oocytes'
        RIBOmap
        探针浓度（50 nM）、杂交温度和时间（40 °C 4-6 h）、连接条件（25 °C 1.5 h）、扩增条件（30 °C 2 h）、固定条件（2%甲醛 37 °C 30 min）
        阅读提示：Methods 'Modified RIBOmap'
        报告mRNA翻译检测
        报告mRNA注射量（4 pl，1 μM）、mScarlet对照浓度、RO-3306浓度（10 μM）、检测时间点（8 h或3 h和8 h）
        阅读提示：Methods 'Translation of mRNAs with different poly(A) lengths' 和 Figure 3、4图注
        tdPCP-PP7招募实验
        报告mRNA浓度（0.2 μM）、mScarlet浓度（0.1 μM）、tdPCP融合蛋白mRNA浓度（0.5 μM）、检测时间点（2 h和8 h）、PP7拷贝数（2×或10×）
        阅读提示：Methods 'tdPCP-PP7 tethering assay' 和 Figure 6图注
        活细胞成像
        mClover3-Map4-MTBD和H2B-mRFP mRNA浓度（100 ng/μl）、注射体积（2 pl）、成像条件（LSM 880，40×物镜）
        阅读提示：Methods 'Labeling of spindle and chromosomes in live oocytes' 和 'Confocal microscopy'
        RNA干扰
        siRNA浓度（100 μM）、注射体积（4 pl）、Ccnb1 RNAi后培养时间（24 h）、Pabpc4 RNAi在卵泡中培养9天
        阅读提示：Methods 'RNA interference'
        poly(A)尾长度检测
        卵母细胞数量（20个）、试剂盒（Poly(A) Tail-Length Assay Kit）、PCR引物序列
        阅读提示：Methods 'Poly(A) tail length assay'

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