CRISPR筛选与凝集素微阵列鉴定高甘露糖N-聚糖调控因子

CRISPR screens and lectin microarrays identify high mannose N-glycan regulators.

作者信息C Kimberly Tsui, Nicholas Twells, Jenni Durieux, Emma Doan, Jacqueline Woo, Noosha Khosrojerdi, Janiya Brooks, Ayodeji Kulepa, Brant Webster, Lara K Mahal, Andrew Dillin

PMID39557836

期刊Nat Commun

发布时间2024-11-18

DOI10.1038/s41467-024-53225-1

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实验完整度

高

采用全基因组及靶向CRISPR筛选、凝集素微阵列、UPLC与MALDI-TOF糖组学、免疫荧光及CLEM等多层级验证

主要模型

A549肺腺癌细胞系（dox诱导XBP1s表达） K562细胞系 Jurkat细胞系 293T细胞系

重点核对

dox诱导XBP1s表达及HHL/GRFT/MBL2结合变化全基因组CRISPR敲除筛选（dox处理48小时，HHL-FITC染色，分选前后各25%）靶向CRISPRi文库筛选（292个基因，每个5条sgRNA） TM9SF3与CCDC22敲低后的高尔基体标志物GM130/TGN46共定位及形态凝集素微阵列与N-糖组学检测全局糖基化变化

摘要

聚糖在细胞信号传导和功能中发挥关键作用。与蛋白质不同，聚糖结构并非由基因序列模板编码，而是由众多基因协同合成，这一特点使其研究历来充满挑战。本文提出一种利用CRISPR筛选和凝集素微阵列揭示并表征糖基化调控因子的策略。我们将该策略应用于研究高甘露糖聚糖——所有天冬酰胺（N）连接聚糖的起始结构——的调控。利用CRISPR筛选，我们揭示了控制高甘露糖水平的扩展基因网络，随后通过凝集素微阵列全面测量了所选调控因子对全局糖基化的复杂影响。据此，我们阐明了两个高甘露糖调控因子——TM9SF3和CCC复合物——如何通过调控高尔基体形态与功能来控制复杂N-糖基化。值得注意的是，这使我们能够深入探究高尔基体功能，并揭示高尔基体形态的类似破坏可导致截然不同的糖基化结局。总之，本工作展示了一种可推广的策略，用于系统解析糖基化背后的调控网络。

建立XBP1s诱导的高甘露糖细胞模型

构建可控激活UPRER并上调高甘露糖的细胞体系

将dox诱导型XBP1s慢病毒导入A549细胞，检测XBP1s靶基因表达及HHL、GRFT、MBL2结合变化，并用UPLC和凝集素微阵列分析高甘露糖结构

全基因组CRISPR敲除筛选高甘露糖调控因子

发现调控细胞表面高甘露糖水平的基因网络

在稳定表达Cas9和dox诱导XBP1s的A549细胞中转导全基因组sgRNA文库，dox诱导后HHL-FITC染色，FACS分选HHL信号前后各25%细胞，深度测序并用casTLE分析

靶向CRISPRi筛选及候选基因验证

在基础和XBP1s诱导条件下验证并扩展高甘露糖调控因子

构建靶向292个基因的CRISPRi亚文库，利用HHL偶联磁珠的MACS分离高/低结合细胞，深度测序分析，并用竞争性HHL结合实验验证候选基因

TM9SF3调控糖基化的机制解析

确定TM9SF3对高尔基体组织及N-糖基化加工的影响

建立TM9SF3敲低A549细胞，检测HHL结合、GM130与TGN46染色及共定位、CLEM观察高尔基体结构，并用凝集素微阵列和N-糖组学分析全局糖基化

CCC复合物调控糖基化的机制解析

确定CCC复合物对高尔基体功能及复杂N-糖基化的影响

建立CCDC22等CCC成员敲低细胞，检测高甘露糖结合、高尔基体形态与共定位、CLEM，并用凝集素微阵列和N-糖组学分析糖基化变化

实验环节	名称	品牌	货号
细胞培养	DMEM培养基	Gibco	11966025
胎牛血清	Avantor	97068-085
青霉素-链霉素	Gibco	15070063
RPMI培养基	Gibco	11875093
GlutaMAX添加剂	Gibco	35050061
XBP1s诱导	多西环素	Sigma	D3072
RNA提取与逆转录	TRIzol试剂	Invitrogen	15596026
RNA提取	RNeasy微量试剂盒	Qiagen	74004
cDNA合成	QuantiTect逆转录试剂盒	Qiagen	205311
RT-qPCR	SYBR Green预混液	Applied Biosystem	A46109
QuantStudio 6 Flex实时PCR仪	--	--
细胞解离	Accutase细胞解离液	Gibco	A11105-01
流式分析	杜氏磷酸盐缓冲液	HyClone	SH30264.02
甘露糖结合凝集素2蛋白	Abcam	ab151947
FITC标记的HHL凝集素	Glycomatrix	21511092-1
Alexa Fluor 488标记抗His抗体	Biotechne	IC0501G
GNL凝集素	Vector Laboratories	FL-1241-2
Lch凝集素	EY Laboratories	F-1401-5
SNA凝集素	Bioworld	21500045-1
CSA凝集素	EY Laboratories	BA-3201-1
蛋白质提取	cOmplete蛋白酶抑制剂	Roche	11836170001
CRISPR筛选	嘌呤霉素	Gibco	A1113803
蛋白酶K	Qiagen	19133
Qiagen血液DNA中量提取试剂盒	Qiagen	51183
MACS筛选	MojoSort链霉亲和素纳米磁珠	BioLegend	480016
MojoSort缓冲液	BioLegend	480017
细胞内染色	小鼠抗GM130抗体	BD Bioscience	BDB610822
兔抗TGN46抗体	ProteinTech	13573-1-AP
山羊抗小鼠二抗	Invitrogen	A-11015
山羊抗兔二抗	Invitrogen	A-11011
免疫荧光	Alexa Fluor 647鬼笔环肽	Thermofisher	A30107
含DAPI的VectaShield封片剂	Vector Laboratories	H-1800-2
Nikon Ti-E倒置显微镜	Nikon Instruments	--
Zyla 5.5相机	Andor Technology	--
CLEM	网格盖玻片	Mattek	P35G-1.5-14-C-GRD
FEI Tecnai 12 120 kV透射电镜	FEI	--
Gatan Rio 16 CMOS相机	Gatan	--

实验环节

名称

品牌

货号

细胞培养

DMEM培养基

Gibco

11966025

胎牛血清

Avantor

97068-085

青霉素-链霉素

Gibco

15070063

RPMI培养基

Gibco

11875093

GlutaMAX添加剂

Gibco

35050061

XBP1s诱导

多西环素

Sigma

D3072

RNA提取与逆转录

TRIzol试剂

Invitrogen

15596026

RNA提取

RNeasy微量试剂盒

Qiagen

74004

cDNA合成

QuantiTect逆转录试剂盒

Qiagen

205311

RT-qPCR

SYBR Green预混液

Applied Biosystem

A46109

QuantStudio 6 Flex实时PCR仪

细胞解离

Accutase细胞解离液

Gibco

A11105-01

流式分析

杜氏磷酸盐缓冲液

HyClone

SH30264.02

甘露糖结合凝集素2蛋白

Abcam

ab151947

FITC标记的HHL凝集素

Glycomatrix

21511092-1

Alexa Fluor 488标记抗His抗体

Biotechne

IC0501G

GNL凝集素

Vector Laboratories

FL-1241-2

Lch凝集素

EY Laboratories

F-1401-5

SNA凝集素

Bioworld

21500045-1

CSA凝集素

EY Laboratories

BA-3201-1

蛋白质提取

cOmplete蛋白酶抑制剂

Roche

11836170001

CRISPR筛选

嘌呤霉素

Gibco

A1113803

蛋白酶K

Qiagen

19133

Qiagen血液DNA中量提取试剂盒

Qiagen

51183

MACS筛选

MojoSort链霉亲和素纳米磁珠

BioLegend

480016

MojoSort缓冲液

BioLegend

480017

细胞内染色

小鼠抗GM130抗体

BD Bioscience

BDB610822

兔抗TGN46抗体

ProteinTech

13573-1-AP

山羊抗小鼠二抗

Invitrogen

A-11015

山羊抗兔二抗

Invitrogen

A-11011

免疫荧光

Alexa Fluor 647鬼笔环肽

Thermofisher

A30107

含DAPI的VectaShield封片剂

Vector Laboratories

H-1800-2

Nikon Ti-E倒置显微镜

Nikon Instruments

Zyla 5.5相机

Andor Technology

CLEM

网格盖玻片

Mattek

P35G-1.5-14-C-GRD

FEI Tecnai 12 120 kV透射电镜

FEI

Gatan Rio 16 CMOS相机

Gatan

环节	核对要点
XBP1s诱导与高甘露糖检测	dox浓度2 µg/mL、处理48小时；HHL-FITC 10 µg/mL；实验至少三次独立重复阅读提示：Methods中RT-qPCR、流式分析及Fig. 1图注
全基因组CRISPR敲除筛选	文库感染MOI 0.3–0.4；嘌呤霉素1 µg/mL筛选3–4天；dox处理48小时；分选前后各25%且每群至少1000倍覆盖；实验重复两次阅读提示：Methods中FACS-based CRISPR-deletion screen及Fig. 2a图注
MACS靶向CRISPRi筛选	292个基因、每基因5条sgRNA、540条对照；每条件5000万细胞；HHL-磁珠孵育1小时4°C；三轮磁分离；实验重复两次阅读提示：Methods中MACS-based CRISPR-inhibition screens及Fig. 3a图注
TM9SF3与CCDC22敲低验证	每个基因两条独立sgRNA；GM130 1:250、TGN46 1:500染色；共定位定量来自至少12张图像、每图>20个细胞阅读提示：Methods中免疫荧光及Fig. 4d、Fig. 5d图注
凝集素微阵列与N-糖组学	每样本20 µg蛋白进行微阵列；N-糖组学每样本一千万细胞；糖组学数据处理方式阅读提示：Methods中Lectin microarrays与MALDI-TOF N-glycomics小节

环节

核对要点

XBP1s诱导与高甘露糖检测

dox浓度2 µg/mL、处理48小时；HHL-FITC 10 µg/mL；实验至少三次独立重复

阅读提示：Methods中RT-qPCR、流式分析及Fig. 1图注

全基因组CRISPR敲除筛选

文库感染MOI 0.3–0.4；嘌呤霉素1 µg/mL筛选3–4天；dox处理48小时；分选前后各25%且每群至少1000倍覆盖；实验重复两次

阅读提示：Methods中FACS-based CRISPR-deletion screen及Fig. 2a图注

MACS靶向CRISPRi筛选

292个基因、每基因5条sgRNA、540条对照；每条件5000万细胞；HHL-磁珠孵育1小时4°C；三轮磁分离；实验重复两次

阅读提示：Methods中MACS-based CRISPR-inhibition screens及Fig. 3a图注

TM9SF3与CCDC22敲低验证

每个基因两条独立sgRNA；GM130 1:250、TGN46 1:500染色；共定位定量来自至少12张图像、每图>20个细胞

阅读提示：Methods中免疫荧光及Fig. 4d、Fig. 5d图注

凝集素微阵列与N-糖组学

每样本20 µg蛋白进行微阵列；N-糖组学每样本一千万细胞；糖组学数据处理方式

阅读提示：Methods中Lectin microarrays与MALDI-TOF N-glycomics小节

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