小鼠组织样本采集与处理
获取不同年龄小鼠主要组织，用于蛋白质组和转录组分析。
采集6、15、24、30月龄雄性C57BL/6J小鼠的脑、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、皮肤和胸主动脉，以及雌性C57BL/6J、CB6F1和BALB/c小鼠的相应组织；组织在液氮中速冻并粉碎。
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衰老小鼠蛋白质组图谱揭示年龄相关转录后失调的特征
An atlas of the aging mouse proteome reveals the features of age-related post-transcriptional dysregulation.
实验完整度
高多组织蛋白质组与转录组分析，含Western blot、免疫荧光、单细胞数据再分析及AAV体内功能验证。
主要模型
6、15、24、30月龄雄性C57BL/6J小鼠多组织 6和30月龄雌性C57BL/6J小鼠心脏和肾脏 4和32月龄雄性CB6F1小鼠肾脏 4和24月龄雌性BALB/c小鼠肾脏
重点核对
差异表达蛋白（DEP）阈值：倍数变化>1.5且FDR<0.05 蛋白质组学：16-plex TMT标记，Orbitrap Fusion Lumos质谱，每组4个生物学重复 转录组学：bulk RNA-Seq，与蛋白质组同批组织粉末，差异表达阈值同DEP AAV介导Xbp1s过表达：15月龄小鼠单次静脉注射1×10^13 vg/mouse，3个月后行为学测试 Western blot验证：APOE、Endostatin、HSPA5抗体1:1000稀释，n=4
摘要
转录后失调在多大程度上以及如何影响衰老蛋白质组仍不清楚。在这里，我们提供了6、15、24和30月龄小鼠主要组织的全组织裂解物（WTL）和低溶解度蛋白富集组分（LSF）的蛋白质组数据。低溶解度蛋白优先受年龄影响，对LSF的分析使鉴定出的年龄差异表达蛋白数量翻倍。使用相同的组织匀浆同时分析蛋白质组和转录组，揭示了年龄相关转录后失调的特征。转录后失调在24月龄后尤为明显，并且年龄相关转录后失调导致多个组织中核心基质体蛋白的积累和线粒体膜蛋白的减少。基于我们深入的蛋白质组数据和成年、中年、老年和高龄小鼠的样本匹配转录组数据，我们构建了小鼠衰老蛋白质组图谱（https://aging-proteomics.info/），提供了年龄相关基因表达变化的全面综合视图。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 衰老过程中蛋白质组如何变化，转录后失调在多大程度上以及如何影响衰老蛋白质组，以及这些变化在多个组织中是否存在共同特征。
- 核心机制
- 年龄相关转录后失调导致核心基质体蛋白在多个组织中积累和线粒体膜蛋白减少；在衰老肌肉中XBP1通路激活，Xbp1s表达增加， contributes to年龄相关运动能力下降。
- 主要证据
- 对6、15、24、30月龄小鼠多组织WTL和LSF进行TMT定量蛋白质组学，并与同一样本的转录组数据比较，发现LSF使DEP数量翻倍，核心基质体和线粒体膜蛋白在DEP中富集且多不伴随mRNA变化；Western blot验证APOE和HSPA5，免疫荧光显示APOE在衰老心脏细胞外增加；AAV介导Xbp1s过表达降低小鼠运动表现。
- 研究意义
- 构建了小鼠衰老蛋白质组图谱（https://aging-proteomics.info/），提供了年龄相关基因表达变化的全面综合视图，可作为未来衰老研究的资源。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
WTL和LSF蛋白质组样品制备
制备全组织裂解物和低溶解度蛋白富集组分，以增加蛋白质组覆盖深度。
WTL用2×Laemmli缓冲液（4% SDS）提取；LSF先用低浓度SDS溶液预孵育去除高溶解度蛋白，再将残留物溶于2×Laemmli缓冲液。
定量蛋白质组学分析
鉴定和定量不同年龄小鼠组织中的蛋白质，识别年龄差异表达蛋白。
使用16-plex TMT标记和Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪进行LC-MS/MS分析，搜索Uniprot数据库，用limma进行差异表达分析。
转录组学分析
获取与蛋白质组同源样本的mRNA表达数据，用于比较转录本和蛋白质水平的变化。
对相同冻存组织粉末进行bulk RNA-Seq，使用Illumina NovaSeq 6000测序，DESeq2进行差异表达分析。
蛋白质组与转录组数据整合分析
鉴定不伴随mRNA水平显著变化的差异表达蛋白，揭示转录后失调特征。
比较6和30月龄小鼠的DEP和DER，计算重叠和一致性，定义仅蛋白质水平显著变化的基因，分析核心基质体和线粒体膜蛋白的富集。
公共单核RNA-Seq数据再分析
探究DEP的细胞来源。
分析公共成年雄性C57BL/6小鼠心脏、肾脏、肝脏、肺和肌肉的单核RNA-Seq数据，将DEP的mRNA表达定位到细胞类型。
DEP的Western blot和免疫荧光验证
验证质谱鉴定的年龄差异表达蛋白。
对APOE、Endostatin、HSPA5进行Western blot，对心脏APOE进行免疫荧光染色。
Xbp1s过表达功能验证
验证XBP1通路激活对衰老肌肉运动能力的影响。
通过AAV介导在15月龄小鼠肌肉中过表达Xbp1s，3个月后进行转棒、跑台和握力测试。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织采集 | Veet脱毛膏 | Reckitt Benckiser | -- |
| 蛋白质提取 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Nacalai Tesque | 04080 |
| 蛋白质定量 | DC蛋白测定试剂盒 | Bio-Rad | 500-0111 |
| 肽段纯化 | S-Trap mini柱 | Protifi | -- |
| TMT标记 | TMT同量异位标签试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 肽段清理 | OASIS HLB μElution板 | Waters | -- |
| 高pH反相分级 | Gemini C18色谱柱 | Phenomenex | -- |
| LC-MS/MS | Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| UltiMate 3000 RSLC纳升液相色谱系统 | Dionex | -- | |
| nanoEase M/Z HSS T3色谱柱 | Waters | -- | |
| Western blot | 抗APOE抗体 | ABclonal Biotechnology | A16344 |
| 抗内皮抑素抗体 | R&D systems | AF570 | |
| 抗HSPA5抗体 | Proteintech | 11587-1-AP | |
| 抗Vinculin抗体 | Sigma | V9131 | |
| 免疫荧光 | 抗APOE抗体 | Cell Signaling Technology | 68587 |
| 抗层粘连蛋白a2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-59854 | |
| Alexa Fluor 488标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | A11037 | |
| Alexa Fluor 594标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | A11006 | |
| ProLong Gold封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36930 | |
| RNA提取 | RNAiso Plus | Takara | 9108 |
| 逆转录 | PrimeScript RT试剂盒 | Takara | RR036A |
| 实时PCR | TB Green Premix Ex Taq II | Takara | RR820B |
| StepOne-Plus实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA-Seq | Illumina链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | 20040534 |
| NovaSeq 6000测序系统 | Illumina | -- | |
| NovaSeq 6000 S2试剂盒v.1.5 | Illumina | -- | |
| AAV生产 | HEK293T细胞 | ATCC | CRL-3216 |
| pRC1质粒 | Takara | 6672 | |
| 行为学测试 | 转棒仪MK-630B | Muromachi Kikai | -- |
| 线性跑台MK-690S | Muromachi Kikai | -- | |
| 握力计MK-380Si | Muromachi Kikai | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白质组学分析 | 小鼠品系、年龄、性别、每组生物学重复数（4）、TMT标记方法（16-plex）、质谱仪型号（Orbitrap Fusion Lumos）、差异表达阈值（fold change > 1.5, FDR < 0.05） 阅读提示：Methods: Mice; Quantitative proteomic mass spectrometry analysis using multiplex TMT labeling and Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer; Fig. 1 legend |
| LSF制备 | SDS预孵育浓度（心脏、肾脏、肺、皮肤为0.125%，肌肉为0.25%）、孵育时间（72小时）、缓冲液成分（2×Laemmli buffer with 4% SDS） 阅读提示：Methods: Protein extraction, quantification, trypsin digestion, and peptide purification |
| 转录组学分析 | 样本来源（与蛋白质组同批组织粉末）、测序平台（NovaSeq 6000）、差异表达分析软件（DESeq2）、阈值（fold change > 1.5, FDR < 0.05） 阅读提示：Methods: Bulk RNA-Seq analysis |
| AAV介导Xbp1s过表达 | AAV血清型（AAV1）、启动子（MHCK7）、注射剂量（1×10^13 vg/mouse）、注射途径（静脉注射）、注射年龄（15月龄）、测试时间（3个月后） 阅读提示：Methods: AAV production; Fig. 8 legend |
| 行为学测试 | 转棒加速程序（4-40 rpm over 300 s）、跑台速度方案（起始9 m/min，每3分钟增加2 m/min至17 m/min，之后每3分钟增加1 m/min）、握力测试重复次数（3次） 阅读提示：Methods: Exercise performance tests |