FOLR-1与GON-2的表达定位
确定FOLR-1和GON-2是否表达于HSN和NSM血清素能神经元。
构建folr-1p::FOLR-1::GFP、tph-1pDE::FOLR-1::wrmScarlet、gon-2p::GON-2::GFP等转基因，与tph-1p驱动的DsRed或myr-mNeonGreen共表达，进行共聚焦显微成像。
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特定叶酸激活血清素能神经元以调控秀丽隐杆线虫行为
A specific folate activates serotonergic neurons to control C. elegans behavior.
实验完整度
高包含转基因荧光定位、CRISPR突变体、体外共免疫沉淀、钙成像及行为学等多种独立证据层级
主要模型
秀丽隐杆线虫野生型N2 Bristol folr-1(ek44)突变体 gon-2(ok465)/hT2杂合体 HEK293T细胞
重点核对
10F-THF使用浓度10 µM、每板25 µl铺板，估计表面浓度约70.6 nM（0时） 10F-THF和DHP在HSN钙瞬变检测中使用200 nM或40 nM 产卵实验使用饥饿30 min的成年雌雄同体，每组10只，n=10 gon-2使用ok465/hT2杂合体而非纯合体进行产卵和钙瞬变检测 行为学检测中fluoxetine预处理浓度为75 µg/ml
摘要
叶酸是B族维生素，在一碳代谢中发挥作用。本文显示，一种特定叶酸能够激活秀丽隐杆线虫的血清素能神经元，通过需要叶酸受体FOLR-1和GON-2钙通道的途径调控行为。FOLR-1与GON-2在异源系统中存在物理相互作用，且两者均表达于HSN和NSM血清素能神经元。叶酸10-formyl-THF和非代谢性蝶酸均可诱导HSN神经元Ca2+瞬变数目增加及产卵增加，且该效应依赖FOLR-1和GON-2。FOLR-1和GON-2是NSM神经元响应10-formyl-THF活化所必需的，也是饥饿动物遇到细菌时NSM介导的运动停止完全发生所必需的。我们的结果表明FOLR-1独立于一碳代谢发挥作用，并提示10-formyl-THF作为膳食信号激活血清素能神经元，通过涉及钙内流的途径影响行为。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 特定叶酸是否能够通过叶酸受体独立于一碳代谢激活血清素能神经元并调控线虫行为。
- 核心机制
- 10F-THF与FOLR-1结合，FOLR-1与GON-2 TRPM钙通道物理相互作用，促进HSN和NSM神经元钙内流，进而调控产卵和运动停止行为，该过程独立于一碳代谢。
- 主要证据
- folr-1p::FOLR-1::GFP与gon-2p::GON-2::GFP在HSN和NSM共定位；HEK293T细胞共免疫沉淀显示FOLR-1与GON-2物理互作；10F-THF和DHP以FOLR-1、GON-2依赖方式增加HSN钙瞬变和产卵；NSM GCaMP7s/mScarlet比值在野生型中升高而突变体中不升高；folr-1和gon-2突变体运动停止行为改变。
- 研究意义
- 作者提出FOLR-1独立于一碳代谢激活血清素能神经元，提示10F-THF作为膳食信号标记摄入细菌，并提示叶酸受体介导的钙信号调控神经元活动可能在不同物种间保守。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
folr-1缺失突变体构建与验证
获得folr-1功能缺失等位基因并验证其分子效应。
利用CRISPR/Cas9在folr-1第二外显子切割，获得ek44缺失等位基因，测序确认并通过qRT-PCR检测mRNA水平。
10F-THF/DHP对产卵行为的影响
验证特定叶酸和蝶酸是否以FOLR-1和GON-2依赖方式促进产卵。
饥饿30 min的成年雌雄同体置于铺有10F-THF、DHP、其他叶酸或对照缓冲液的平板，计数5、10、60 min产卵数。
FOLR-1与GON-2物理互作检测
检验FOLR-1与GON-2是否存在物理相互作用。
在HEK293T细胞中共表达FOLR-1::3xHA与GON-2::3xFLAG，进行双向免疫共沉淀和Western blot，以ICAM1-3xHA和3xFLAG-FBXW7为阴性对照。
HSN与NSM神经元钙活动检测
检测10F-THF和DHP是否以FOLR-1和GON-2依赖方式改变HSN钙瞬变和NSM钙水平。
使用HSN GCaMP5和NSM GCaMP7b或GCaMP7s::P2A::mScarlet转基因，在10F-THF/DHP或对照缓冲液中成像并量化钙信号。
组织特异性FOLR-1和GON-2拯救实验
确定FOLR-1和GON-2在哪些组织中的表达足以恢复产卵响应。
在folr-1(ek44)或gon-2(ok465)/hT2背景下，用HSN、NSM、咽峡部和咽肠瓣膜细胞特异性启动子表达FOLR-1或GON-2，检测10F-THF诱导的产卵。
NSM介导的运动停止行为检测
评估FOLR-1和GON-2对NSM介导的饥饿动物遇菌停止行为的影响。
饥饿成年动物置于含中央OP50菌圈的平板，摄像追踪接近和接触细菌后的速度、2 min移动距离及离开2.5 mm虚拟圆的时间。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 共免疫沉淀 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 |
| 抗HA亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| Western blot | 小鼠抗FLAG抗体（M2） | Sigma-Aldrich | F3165 |
| 兔抗HA抗体 | Thermo Fisher Scientific | 71-5500 | |
| 山羊抗小鼠HRP | Thermo Fisher Scientific | 31432 | |
| 山羊抗兔HRP | Thermo Fisher Scientific | 31462 | |
| Immobilon-P PVDF膜 | Millipore | -- | |
| ECL Select蛋白质印迹检测试剂 | Cytiva | -- | |
| NuPAGE凝胶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞培养与转染 | Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| CRISPR/Cas9 | Ni-NTA树脂 | Qiagen | -- |
| 药物处理 | 5-甲酰-5,6,7,8-四氢叶酸 | Sigma | -- |
| (6S)-5-甲基-5,6,7,8-四氢叶酸 | Schircks Laboratories | -- | |
| 5,6,7,8-四氢叶酸 | Merck | -- | |
| 7,8-二氢蝶酸 | Schircks Laboratories | -- | |
| 产卵实验 | 琼脂糖 | Sigma Aldrich | A9539 |
| 行为学实验 | 氟西汀 | -- | -- |
| 免疫荧光 | 兔多克隆抗血清素抗体 | Neuromics Inc. | RA20080 |
| IV型胶原酶 | Sigma | -- | |
| 抗兔IgG纳米抗体AlexaFluor 546 | ChromoTek Inc. | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Life Technologies | -- |
| SuperScript IV第一链合成系统 | Life Technologies | -- | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| 分子克隆 | In-Fusion克隆试剂盒 | Takara Bio USA, Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 产卵实验中的10F-THF处理 | 10F-THF终浓度10 µM、每板25 µl、饥饿30 min、成年雌雄同体单排卵、每组10只、观察5/10/60 min；10F-THF需由5,10-methenyl-THF在pH 8.5 Tris中新鲜转化并4 min内铺板 阅读提示：Methods“Egg-laying assay”与Fig. 2a及图注 |
| HSN钙瞬变检测 | 10F-THF或DHP浓度200 nM或40 nM、饥饿30 min、成像1000 s（4000帧）分析、排除前2000帧、钙瞬变异常动物的排除标准、每组n=11–19只动物 阅读提示：Methods“Analysis of HSN Ca2+ transients”与Fig. 4a–c |
| NSM钙水平检测 | GCaMP7s::P2A::mScarlet转基因、200 nM 10F-THF或DHP处理4 min、饥饿1–4 h、n=18只动物 阅读提示：Methods“GCaMP7s/mScarlet ratio”与Fig. 6d、6e |
| folr-1或gon-2突变体遗传背景 | gon-2使用ok465/hT2杂合体进行产卵及HSN钙瞬变检测而非纯合体，纯合体不育；folr-1(ek44)为13 bp缺失移码等位基因 阅读提示：Results相关段落与Methods“Generating the folr-1(ek44) mutation” |
| 运动停止与恢复行为检测 | fluoxetine预处理浓度75 µg/ml、虚拟圆直径2.5 mm、2 min移动距离、摄像1 fps、各组n=32–105只动物 阅读提示：Methods“Velocity and recovery time measurements”与Fig. 6a–c |
| 组织特异性拯救实验 | FOLR-1拯救质粒每种5 ng/µl、GON-2拯救质粒每种25 ng/µl、每种组合2个独立株系；组织启动子来源 阅读提示：Methods“Generation of transgenic strains”与Fig. 5b、Supplementary Fig. 8 |