建立HDM诱导的小鼠哮喘模型并评估ILC2亚群动力学
确定不同ILC2亚群在哮喘发作和缓解期的组织分布及细胞因子产生潜力。
采用i.p. HDM致敏/激发模型和i.n. HDM致敏模型，在不同时间点检测气道高反应性、血清IgE、肺内2型细胞因子、BALF细胞学及不同组织ILC2亚群频率和数量；用PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin刺激后检测IL-13和IL-5。
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TCF-1和TOX调控哮喘肠道2型固有淋巴样细胞的记忆形成
TCF-1 and TOX regulate the memory formation of intestinal group 2 innate lymphoid cells in asthma.
实验完整度
高包含小鼠哮喘模型、联体共生、活体成像、过继移植、体外细胞培养、基因敲低及人PBMC样本验证，涵盖功能与机制验证。
主要模型
HDM诱导的小鼠哮喘模型（i.p.致敏模型和i.n.致敏模型） CD45.1+与CD45.2+小鼠联体共生模型 Rag1–/–小鼠过继移植模型 哮喘缓解期患者PBMC
重点核对
HDM致敏与激发方案：i.p. 50 μg HDM于第0、7、14天，第21–23天i.n. 25 μg HDM；复发于第31–33天i.n. 25 μg HDM ml-ILC2s表型门控：CD45+lineage–CD90.2+NK1.1–NKp46–GATA3+ST2–KLRG1+IL-17RB+ 过继移植剂量与途径：5×10^5个CD45.1+ ml-ILC2s经尾静脉注射入受照CD45.2+小鼠 BrdU标记：i.p.模型第21–23天i.n. 0.8 mg/鼠；i.n.模型第7–11天i.n. 0.8 mg/鼠 基因敲低：体外6 pmol siTcf7/siTox + Lipofectamine RNAiMAX；体内Ambion In Vivo siRNA 1.2 mg/mL + Invivofectamine 3.0经尾静脉注射
摘要
免疫记忆已被扩展至2型固有淋巴样细胞（ILC2s），但其细胞和分子基础仍不完全清楚。基于屋尘螨（HDM）诱导的小鼠哮喘模型和人类样本，我们应用流式细胞术、联体共生、活体成像和过继移植来确认CD45+lineage–CD90.2+NK1.1–NKp46–ST2–KLRG1+IL-17RB+记忆样ILC2s（ml-ILC2s）的持久性、迁移和功能。在CCR9/CCL25和S1P信号调控下，ml-ILC2s在哮喘缓解期驻留于小肠固有层（siLP），随后在再次接触抗原或警报素时移动到气道。此外，ml-ILC2s具有长寿、快速增殖和产生IL-13的特性，并显示Tox和Tcf-7上调的转录特征。ml-ILC2s移植可恢复被Tox和Tcf7敲低所消除的哮喘变化。我们的数据确定siLP ml-ILC2s为记忆样子集，促进哮喘复发。靶向TCF-1和TOX可能有望预防哮喘复发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ILC2s是否具有免疫记忆特性，其细胞和分子基础是什么，以及记忆样ILC2s是否促进哮喘复发。
- 核心机制
- 在CCR9/CCL25和S1P信号调控下，ST2–KLRG1+IL-17RB+ ml-ILC2s在哮喘缓解期驻留于siLP，再次接触抗原或警报素后迁移至气道；TCF-1和TOX维持ml-ILC2s的长寿、增殖、IL-13产生和迁移等记忆样功能。
- 主要证据
- HDM诱导小鼠哮喘模型结合流式细胞术、联体共生、活体成像和过继移植证实siLP ml-ILC2s的持久性、迁移和诱导哮喘复发的能力；Tcf7和Tox敲低削弱ml-ILC2s的增殖、IL-13产生、BrdU保留和迁移能力；哮喘缓解期患者PBMC中存在表型和转录特征相似、具记忆样特征的ST2–KLRG1+IL-17RB+ ILC2s。
- 研究意义
- 研究提示靶向TCF-1和TOX可能有助于预防哮喘复发，并拓展了对先天免疫记忆及肠-肺轴在哮喘中作用的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
过继移植验证siLP来源ml-ILC2s驱动哮喘复发
确定siLP中的ST2–KLRG1+IL-17RB+ ILC2s是否是再次激发后肺内积累并介导哮喘复发的细胞来源。
从哮喘缓解期CD45.1+小鼠的骨髓、脾、肺和siLP分离lineage阴性细胞并体外扩增，分选CD45+lineage–CD90.2+NK1.1–NKp46–ST2–KLRG1+IL-17RB+细胞过继转移至受照CD45.2+小鼠，随后i.n. HDM激发，检测肺内供体来源ILC2s及哮喘指标。
联体共生和活体成像验证ml-ILC2s循环与组织迁移
验证ST2–KLRG1+IL-17RB+ ILC2s是否为循环细胞，并追踪其在哮喘不同阶段的迁移路径。
建立CD45.1+与受照CD45.2+小鼠联体共生，在CD45.1+小鼠诱导HDM哮喘后检测CD45.2+侧siLP中CD45.1+ILC2s；用Xenolight DiR标记ml-ILC2s，过继转移至哮喘发作期或缓解期小鼠，进行活体成像和离体器官成像；使用CCR9拮抗剂CCX282-B、抗α4β7抗体Etrolizumab和S1P拮抗剂FTY720干预。
验证ml-ILC2s介导哮喘复发不依赖适应性免疫细胞
确定ST2–KLRG1+IL-17RB+ ml-ILC2s是否足以在不依赖T/B细胞和预先存在ILC2s的情况下诱导哮喘样反应。
在WT和Rag1–/–小鼠中使用抗KLRG1单抗中和KLRG1；将从HDM刺激Rag1–/–小鼠siLP分选的ml-ILC2s体外用抗KLRG1或同型对照处理后，过继转移至抗CD90.2预处理的Rag1–/–小鼠，随后i.n. HDM或重组IL-25激发，检测肺内ILC2s、IL-13、气道阻力和组织学。
验证siLP ml-ILC2s的记忆样特征
检测siLP ST2–KLRG1+IL-17RB+ ILC2s是否具有长寿、增殖和快速产生IL-13等记忆样特性。
在HDM激发期间i.n.给予BrdU，追踪BrdU+ ml-ILC2s在siLP中的持续时间；分选哮喘缓解期siLP不同ILC2亚群及naive亚群，体外用IL-2、IL-7及IL-25+IL-33刺激，检测Ki-67、细胞扩增和IL-13/IL-5产生。
鉴定Tcf7和Tox对ml-ILC2s记忆样功能的调控
确定Tcf7和Tox是否调控ml-ILC2s的长寿、增殖、细胞因子产生和迁移能力。
分选ml-ILC2s并转染siTcf7、siTox或阴性对照，体外检测扩增、IL-13分泌、相关基因mRNA及CCR9/S1PR1表达；在Rag1–/–小鼠中经尾静脉注射体内siRNA敲低Tcf7或Tox，结合BrdU追踪和过继移植ml-ILC2s，检测哮喘复发指标。
在哮喘患者PBMC中验证人记忆样ILC2s
验证哮喘缓解期患者外周血中存在与小鼠ml-ILC2s表型、功能和转录特征相似的人ILC2s。
采集哮喘缓解期患者和健康志愿者PBMC，流式检测CD45+lineage–CRTH2+CD127+GATA3+ST2–KLRG1+IL-17RB+ ILC2s的频率、IL-13/IL-5产生；分选不同亚群体外用IL-2、IL-7和IL-25+IL-33培养，检测Ki-67、扩增和细胞因子；qRT-PCR检测记忆相关基因。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| HDM致敏与激发 | 屋尘螨提取物 | Stallergenes Greer | B82 |
| 气道阻力测定 | 乙酰甲胆碱 | Sigma-Aldrich | 1396364 |
| BALF细胞学 | 瑞氏-吉姆萨染色液 | Beyotime | C0131-500mL |
| PBMC分离 | Percoll密度梯度分离液 | FCMACS | FMS-FL01 |
| 组织消化 | Liberase TM酶 | Sigma-Aldrich | 5401127001 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| 红细胞裂解 | ACK裂解液 | FCMACS | FMS-RBC100 |
| 流式分析 | 谱系细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-858 |
| Fc受体阻断试剂 | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| LIVE/DEAD可固定死活染料 | -- | -- | |
| 细胞刺激鸡尾酒（含蛋白转运抑制剂） | eBioscience | 00-4975-93 | |
| Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 细胞培养 | 白细胞介素-2 | peprotech | 212-12 |
| 白细胞介素-7 | peprotech | 217-17 | |
| 白细胞介素-25 | R&D Systems | 7909-IL-010/CF | |
| 白细胞介素-33 | R&D Systems | 3626-ML-010/CF | |
| 重组人IL-17E/IL-25 | Peprotech | 200-24 | |
| 重组人IL-33 | R&D Systems | 3625-IL-010/CF | |
| 重组人白细胞介素-2 | Peprotech | 200-02 | |
| 重组人白细胞介素-7 | Peprotech | 200-07 | |
| RNA干扰 | Silencer Select Tcf7小干扰RNA | invitrogen | 4390771 |
| Silencer Select Tox小干扰RNA | invitrogen | 4390771 | |
| Silencer Select阴性对照小干扰RNA | invitrogen | 4390843 | |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | invitrogen | 13778150 | |
| Ambion体内Tcf7小干扰RNA | invitrogen | 4457308 | |
| Ambion体内Tox小干扰RNA | invitrogen | 4457308 | |
| Ambion体内阴性对照小干扰RNA | invitrogen | 4457287 | |
| Invivofectamine 3.0体内转染试剂 | invitrogen | IVF3001 | |
| KLRG1中和 | InVivoMAb抗小鼠KLRG-1单克隆抗体 | BioXCell | BE0201 |
| 同型对照IgG | BioXCell | BE0087 | |
| 抗KLRG-1抗体（克隆2F1） | BioXCell | BE0201 | |
| ILC2清除 | InVivoPlus抗小鼠Thy1.2（CD90.2）抗体 | BioXCell | BP0066 |
| 同型对照IgG2b | BioXCell | BE0090 | |
| 过继移植激发 | 重组白细胞介素-25 | R&D Systems | 7909-IL-025 |
| BrdU标记 | 溴脱氧尿苷 | BD Biosciences | 559619 |
| 活体成像 | Xenolight DiR荧光染料 | PerkinElmer | 125964 |
| CCX282-B | Axon Medchem | 698394-73-9 | |
| Etrolizumab | MedChemExpress | 1044758-60-2 | |
| FTY720 | MedChemExpress | HY-12005 | |
| ELISA | 小鼠IL-4 ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7044-86 |
| 小鼠IL-5 ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7054-86 | |
| 小鼠IL-13 ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7137-88 | |
| 小鼠IL-17A ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7371-86 | |
| 小鼠IgE ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-50460-88 | |
| 小鼠CCL25 ELISA试剂盒 | R&D systems | DY481 | |
| 小鼠MAdCAM-1 ELISA试剂盒 | R&D systems | DY2768 | |
| 小鼠S1P ELISA试剂盒 | Echelon | K-1900 | |
| qRT-PCR | RNeasy微量RNA提取试剂盒 | Qiagen | 74004 |
| HiScript II第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme Biotech | R211-01 | |
| RiboLock RNA酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | EO0381 | |
| SYBR Green PCR预混液 | Vazyme Biotech | Q511-02 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HDM诱导哮喘模型 | HDM来源（Stallergenes Greer，货号B82）、致敏剂量（i.p. 50 μg或i.n. 60 μg）、激发剂量（i.n. 25 μg或60 μg）、时间点及复发激发方案 阅读提示：Methods中“HDM sensitization and challenges”小节及Fig. 1A、Fig. S2A、Fig. S4 |
| ml-ILC2s流式鉴定与分选 | 小鼠门控策略（CD45+lineage–CD90.2+NK1.1–NKp46–GATA3+ST2–KLRG1+IL-17RB+）及人门控策略（CD45+lineage–CRTH2+CD127+GATA3+ST2–KLRG1+IL-17RB+），抗体克隆号和稀释比例 阅读提示：Methods中“Flow cytometry and cell sorting”小节及Fig. 1G、Fig. 7A |
| 过继移植 | 供体细胞来源（BM、脾、肺或siLP）、分选表型、细胞剂量（5×10^5/鼠）、受体处理（受照CD45.2+或抗CD90.2预处理的Rag1–/–）及激发方案 阅读提示：Methods中“Adoptive transfer”小节及Fig. 2A、Fig. 4F、Fig. 6J |
| 联体共生 | 受体照射剂量（Co60，10 Gy）、手术连接方式、恢复时间（4周）及术后饮水抗生素配方 阅读提示：Methods中“Parabiosis”小节及Fig. 3A |
| 活体成像与迁移干预 | DiR标记浓度（5 mM）、细胞剂量（5×10^5/鼠）、CCX282-B（50 mg/kg皮下每日）、Etrolizumab（5 mg/kg静脉第24、26、28、30天）和FTY720（1 mg/kg静脉2次）给药方案 阅读提示：Methods中“Xenolight DiR imaging”小节及Fig. 3C |
| BrdU标记 | BrdU剂量（0.8 mg/鼠i.n.）、给药时间窗（i.p.模型第21–23天；i.n.模型第7–11天）及检测时间点（第1、30、60、90天或第7、60天） 阅读提示：Methods中“Bromodeoxyuridine (BrdU) labeling”小节及Fig. 5A、Fig. S10 |
| 体外细胞培养与刺激 | 细胞接种密度（5×10^3/孔）、IL-2（10 ng/mL）和IL-7（20 ng/mL）浓度、警报素（IL-25和IL-33各200 ng/mL）添加频率及培养时长（14天或21天） 阅读提示：Methods中“In vitro cell culture”小节及Fig. 5E、Fig. 7E |
| RNA干扰 | 体外siRNA用量（6 pmol）和转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX 1 μL）；体内siRNA浓度（1.2 mg/mL）、转染试剂（Invivofectamine 3.0）及注射体积（10 μL/g体重） 阅读提示：Methods中“RNA interference”小节及Fig. 6G、Fig. 6J |
| KLRG1中和 | 体内抗KLRG1剂量（10 mg/kg i.p.）及给药时间（第0、7、14、21天）；体外抗KLRG1浓度（0.75 μg/mL）及处理时长（3天） 阅读提示：Methods中“Neutralization of KLRG1”小节及Fig. 4A、Fig. 4F |
| 人PBMC样本 | 哮喘缓解期定义（无喘息发作≥50天）、受试者数量（18例哮喘、11例健康）及伦理批件号（KY2019039） 阅读提示：Methods中“Human participants”小节及Fig. 7 |