双荧光素酶微小外显子报告基因构建与细胞系建立
构建可灵敏、线性检测微小外显子纳入或跳过的小分子筛选报告系统。
将Mef2d 21 nt微小外显子插入+1 nt（V1）或删除−1 nt（V2），使外显子纳入或跳过分别表达FLuc或NLuc；融合PEST降解序列和3×Flag标签；通过Gateway克隆构建dox诱导的pcDNA5载体，转染N2A Flp-In rtTA3细胞并筛选稳定整合细胞系。
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使用双Nano和Firefly荧光素酶报告基因高通量灵敏筛选微小外显子可变剪接的小分子调节剂
High-throughput sensitive screening of small molecule modulators of microexon alternative splicing using dual Nano and Firefly luciferase reporters.
实验完整度
高包含体外报告基因细胞系、约9.5万化合物高通量筛选、RT-PCR验证、RNA-seq、Western blot、shRNA敲低及Srrm4单倍剂量不足小鼠体内挽救实验
主要模型
N2A双荧光素酶微小外显子报告基因细胞系 NCI-H82小细胞肺癌细胞系 22Rv1、VCaP和NCI-H660神经内分泌前列腺癌细胞系 Srrm4+/Δ7–8单倍剂量不足小鼠模型
重点核对
报告基因细胞系：N2A Flp-In rtTA3细胞，Rosa26位点稳定整合dox诱导的V1/V2 Mef2d微小外显子双荧光素酶报告基因 高通量筛选：约95,000个小分子，终浓度4 μM处理24 h，PKI库为0.5 μM；Dox诱导后第3天检测发光 化合物浓度：初筛4 μM，次筛40 nM–20 μM十浓度二倍稀释；TSA阳性对照40、150或200 nM，Scriptaid 4 μM 体内给药：Srrm4+/Δ7–8小鼠P2–P8每日皮下注射RDR00572 30 mg/kg，共7次，P8取大脑皮层RNA 阴性对照：0.4% DMSO处理；部分实验设PI染色、EdU掺入检测细胞活力与增殖
摘要
可变剪接的紊乱经常导致或促进人类疾病和障碍。因此，需要高效且灵敏的报告基因检测方法，能够筛选化合物库中以调节重要剪接事件为功效的化合物。在此，我们描述了一种筛选流程，采用双Nano和Firefly荧光素酶可变剪接报告基因，能够实现对小分子反应的高效、灵敏和线性检测。将该系统应用于约95,000个小分子的筛选，鉴定出刺激或抑制神经元微小外显子剪接的化合物，微小外显子是一类可变外显子，常在自闭症中被破坏，并在神经内分泌癌中被激活。其中一个化合物挽救了Srrm4单倍剂量不足的自闭症小鼠模型大脑皮层中若干被分析微小外显子的剪接，Srrm4是脑微小外显子的主要激活因子。因此，我们描述了一种广泛适用的高通量筛选系统，用于鉴定候选剪接治疗药物，以及一个小分子微小外显子调节剂资源，具有进一步开发以纠正与人类疾病和障碍相关的异常剪接模式的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否建立高效、灵敏且线性的双荧光素酶可变剪接报告基因筛选系统，从大规模小分子库中鉴定调节神经元微小外显子剪接的化合物，并验证其在自闭症相关模型中的体内活性。
- 核心机制
- 筛选获得的激活剂和抑制剂通过不同上游机制影响微小外显子剪接：Trametinib上调SRRM4蛋白并促进其结合靶外显子上游；HDAC抑制剂CI-994和BRD6688部分依赖SRRM4发挥作用；RDR00572则可能以不依赖SRRM4的方式起作用；抑制剂AW00693和T5985871可能通过抑制SRRM4、SRRM3表达并促进RBM38表达来抑制微小外显子剪接。
- 主要证据
- 双荧光素酶报告基因发光比值与RT-PCR PSI高度相关（Mef2d V1/V2 r=0.996）；约95,000化合物筛选鉴定738个候选激活剂和644个候选抑制剂；RT-PCR验证91个化合物对Mef2d及内源微小外显子的影响；RNA-seq分析27个化合物；Western blot和shRNA敲低验证SRRM4依赖机制；Srrm4+/Δ7–8小鼠皮下注射RDR00572 30 mg/kg后四个Srrm4依赖微小外显子剪接恢复至接近野生型水平。
- 研究意义
- 提供了一种广泛适用的高通量筛选系统，用于鉴定候选剪接治疗药物，并建立了可用于进一步研究微小外显子剪接调控通路及开发体内应用的小分子调节剂资源。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
报告基因对SRRM4的剂量响应与线性验证
验证报告基因发光比值能否灵敏、线性反映微小外显子剪接变化。
在稳定表达V1或V2报告基因的N2A细胞中转染递增量的SRRM4表达载体，检测Nano和Firefly发光比值，并以RT-PCR测定PSI进行相关分析；同时用抗Flag Western blot检测蛋白异构体变化，并构建Shank2微小外显子报告基因作比较。
高通量小分子筛选与命中化合物初筛
从大规模小分子库中鉴定调节Mef2d微小外显子剪接的候选激活剂和抑制剂。
在384孔板中接种N2A报告基因细胞，加入小分子化合物，6小时后加入Dox诱导报告基因表达，24小时处理后检测Nano和Firefly发光；计算B-score比值，用双曲线阈值区分真正的剪接调节剂与单向发光变化假阳性。
候选化合物浓度依赖性与二次验证
对初筛命中化合物进行浓度依赖性验证并确定有效浓度范围。
从初筛中挑选567个候选化合物，使用Mef2d V1报告基因进行十浓度二倍稀释系列检测，确定最小和最大有效浓度范围。
RT-PCR验证化合物对内源微小外显子剪接的影响
验证化合物对Mef2d报告基因及内源神经微小外显子剪接的实际影响。
用优化浓度的91个化合物处理N2A细胞，RT-PCR检测Mef2d报告基因微小外显子及内源Mef2d、Mast2、Ergic3、Trappc9微小外显子和Zdhhc20、Mgrn1、Asph长盒式外显子的PSI变化，并与初筛发光比值进行相关分析。
RNA-seq全转录组分析化合物对剪接和基因表达的影响
全局评估代表性化合物对可变剪接类别和基因表达的影响及选择性。
选取27个代表性激活剂和抑制剂处理N2A细胞24小时，提取polyA+ RNA进行RNA-seq，分析微小外显子、盒式外显子、可变5′/3′剪接位点和内含子保留事件的变化，并进行GO富集和基因表达分析；同时检测细胞形态、活力和增殖。
神经内分泌癌细胞系中抑制剂化合物功能验证
在疾病相关背景下验证微小外显子抑制剂对SRRM4依赖微小外显子及神经内分泌标志物表达的影响。
用四种微小外显子抑制剂处理NCI-82小细胞肺癌细胞48小时，RT-PCR检测SRRM4依赖微小外显子和REST4剪接；RT-qPCR检测REST/REST4、SRRM3、SRRM4、SYP等神经内分泌标志物；并在22Rv1、VCaP和NCI-H660前列腺癌细胞中检测AW00693和T5985871的浓度依赖效应。
机制研究：剪接调控因子表达与SRRM4依赖性
探究化合物影响微小外显子剪接的分子机制及对SRRM4的依赖程度。
利用N2A RNA-seq数据分析RNA结合蛋白表达变化；Western blot检测SRRM4、PTBP1、QKI、RBFOX2、RBM38等蛋白水平；分析Rbm38敲低与化合物处理对微小外显子影响的 overlap；在Srrm4 shRNA敲低的N2A细胞中检测Trametinib、CI-994、BRD6688和RDR00572的剪接激活效应。
Srrm4单倍剂量不足小鼠体内剪接挽救验证
评估微小外显子激活剂在自闭症相关小鼠模型体内挽救微小外显子剪接的能力。
对Srrm4+/Δ7–8小鼠从P2至P8每日皮下注射SAHA/Vorinostat或RDR00572，P8取大脑皮层RNA，RT-PCR检测四个Srrm4依赖微小外显子的剪接水平，并与野生型和DMSO对照比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 荧光素酶报告基因检测 | Nano-Glo双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | N1610 |
| 高通量筛选液体处理 | Biomek FX实验室自动化工作站 | Beckman Coulter | -- |
| 高通量筛选化合物添加 | Multimek移液工作站 | Beckman | -- |
| 发光检测 | Envision酶标仪 | Perkin Elmer | -- |
| RNA提取 | QIAGEN RNeasy迷你试剂盒 | QIAGEN | -- |
| RT-PCR | QIAGEN一步法RT-PCR试剂盒 | QIAGEN | -- |
| RT-qPCR | FastStart通用SYBR Green预混液试剂盒 | Roche Applied Science | -- |
| Maxima H Minus第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| 细胞增殖检测 | Click-iT EdU细胞增殖试剂盒Alexa fluor 555 | Thermo Fisher | -- |
| 流式分析 | BD LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| Western blot | 小鼠抗α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T6074 |
| 小鼠抗PTBP1抗体 | Invitrogen | 32-4800 | |
| 小鼠抗QKI抗体 | EMD Millipore | MABN624 | |
| 兔抗Rbfox2抗体 | Bethyl | A300-864A-T | |
| 兔抗Srsf11抗体 | Thermo Fisher | PA5-37056 | |
| 兔抗Rbm38抗体 | Abcam | ab200403 | |
| 细胞系构建 | pOG44 Flp重组酶表达载体 | Thermo Fisher Scientific | V600520 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 高通量小分子筛选 | 细胞接种密度、化合物终浓度、处理时间、Dox诱导时间与浓度、发光检测试剂 阅读提示：Methods中High-throughput small molecule screening的Primary screen小节 |
| 报告基因细胞系构建 | 报告基因整合位点、启动子类型、诱导条件、筛选抗生素浓度 阅读提示：Methods中Generation of stable N2A Flp-In rtTA3 cell lines小节及Fig. 1A图注 |
| RT-PCR验证 | RNA用量、扩增循环数、引物序列、PSI定量方法 阅读提示：Methods中RNA extraction, RT-PCR, and RT-(q)PCR assays小节 |
| 体内挽救实验 | 小鼠基因型、给药剂量与途径、给药时间窗口、注射次数、取材时间 阅读提示：Methods中In vivo rescue experiments小节及Fig. 7A图注 |
| RNA-seq分析 | 生物学重复数、差异剪接阈值、基因表达差异阈值、分析流程版本 阅读提示：Methods中RNA-seq analysis及AS analysis小节 |