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        Mst1介导的FoxO1与C/EBP-β磷酸化激发心肌细胞的细胞保护机制

        Mst1-mediated phosphorylation of FoxO1 and C/EBP-β stimulates cell-protective mechanisms in cardiomyocytes.

        作者信息Yasuhiro Maejima, Jihoon Nah, Zahra Aryan, Peiyong Zhai, Eun-Ah Sung, Tong Liu, Koichiro Takayama, Siavash Moghadami, Tetsuo Sasano, Hong Li, Junichi Sadoshima
        PMID39060225
        期刊Nat Commun
        发布时间2024-07-25
        DOI10.1038/s41467-024-50393-y
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        涵盖体外心肌细胞、多种基因修饰小鼠、I/R与缺血模型、ChIP-seq、质谱及激酶实验，含功能与机制验证

        主要模型

        新生大鼠原代心肌细胞 心脏特异性FoxO1敲除小鼠 Tg-Mst1及Tg-Mst1-FoxO1-cKO双基因小鼠 C/EBP-β-T250E敲入小鼠

        重点核对

        FoxO1被Mst1磷酸化的六个位点：Ser209/Ser215/Ser218/Thr228/Ser232/Ser243 C/EBP-β被Mst1磷酸化的位点：人Thr299/小鼠Thr250/大鼠Thr251 腺病毒转导剂量10 MOI，H2O2处理浓度10 μM 小鼠I/R手术：缺血45 min、再灌注24 h；梗死面积以AAR/LV和梗死面积/AAR评估 心肌缺血模型缺血4 h；ChIP-seq每组3只小鼠心脏合并

        摘要

        FoxO转录因子介导截然相反的细胞反应（即死亡与存活）的分子机制尚不清楚。本文显示，Mst1磷酸化FoxO1的Ser209/Ser215/Ser218/Thr228/Ser232/Ser243位点，从而抑制FoxO1介导的促凋亡基因转录。另一方面，Mst1增强FoxO1与C/EBP-β的相互作用，并通过在Thr299位点磷酸化C/EBP-β而激活之，从而促进促存活基因的转录。心肌缺血/再灌注损伤在心脏特异性FoxO1敲除小鼠中大于对照小鼠。然而，同时存在C/EBP-β T299E磷酸化模拟突变可减小心脏特异性FoxO1敲除小鼠的梗死面积。C/EBP-β磷酸化模拟突变体与促存活基因启动子的结合强于野生型C/EBP-β。总之，Mst1对FoxO1的磷酸化抑制FoxO1与促凋亡基因启动子的结合，但增强其与C/EBP-β的结合、C/EBP-β的磷酸化以及促存活基因的转录，从而激发心脏中的保护机制。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        FoxO转录因子如何在同一细胞中介导死亡与存活这两种截然相反的反应，其分子机制尚不清楚。
        核心机制
        Mst1磷酸化FoxO1的DBD多个位点，抑制其与促凋亡基因启动子结合，同时增强FoxO1与C/EBP-β结合；Mst1依赖FoxO1磷酸化C/EBP-β Thr299（人）/Thr250（小鼠），促进C/EBP-β同源二聚化与转录激活，上调促存活/抗氧化基因。
        主要证据
        体外激酶实验与质谱确定磷酸化位点；心肌细胞中免疫印迹、免疫荧光、报告基因、DNA pull-down与EMSA验证DNA结合与转录；Tg-Mst1、FoxO1-cKO、Tg-Mst1-FoxO1-cKO及C/EBP-β-KI小鼠的I/R与缺血模型评估梗死面积、心功能与TUNEL；ChIP-seq显示C/EBP-β与FoxO1在Cat、Mnsod启动子竞争结合。
        研究意义
        揭示Mst1通过磷酸化将FoxO1由促死亡转变为促存活分子的负反馈保护机制，为减轻心肌缺血/再灌注损伤提供机制依据。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        Mst1与FoxO1相互作用及磷酸化位点鉴定

        验证Mst1是否直接结合并磷酸化FoxO1，确定磷酸化位点。

        心肌细胞免疫共沉淀与体外pull-down验证相互作用；体外激酶实验结合32P-ATP和质谱鉴定小鼠FoxO1磷酸化位点；构建FoxO1-PR与S209A突变体腺病毒。

        2

        Mst1对FoxO1核转位与蛋白稳定性的调控

        明确Mst1磷酸化对FoxO1亚细胞定位、泛素化降解及DNA结合能力的影响。

        免疫荧光检测FoxO1核定位；GST-TUBE2检测泛素化FoxO1；3×IRS报告基因、生物素DNA pull-down与EMSA检测DNA结合。

        3

        Mst1–FoxO1对心肌细胞凋亡的功能验证

        验证FoxO1在Mst1存在下对心肌细胞凋亡的作用。

        TUNEL检测心肌细胞凋亡；比较FoxO1过表达、shRNA敲低及FoxO1-PR突变对Mst1或H2O2诱导凋亡的影响。

        4

        FoxO1与C/EBP-β相互作用及C/EBP-β磷酸化

        阐明Mst1如何通过FoxO1激活C/EBP-β。

        pull-down与免疫共沉淀检测FoxO1–C/EBP-β结合；体外激酶与质谱鉴定C/EBP-β Thr299；制备磷酸化特异性抗体；检测C/EBP-β二聚化。

        5

        C/EBP-β对促存活与促凋亡基因转录的调控

        确定C/EBP-β磷酸化对FoxO1靶基因表达的影响。

        RT2 Profiler PCR array与qRT-PCR检测靶基因；报告基因分析Cat启动子上DBE、CCAAT盒与CEBE突变；免疫印迹检测catalase、PRDX2、FASLG、PMAIP1。

        6

        体内缺血/再灌注与缺血模型验证保护作用

        在体验证Mst1–FoxO1–C/EBP-β通路的保护作用。

        Tg-Mst1、Tg-DN-Mst1、FoxO1-cKO、C/EBP-β+/−及双基因小鼠行缺血4 h或I/R手术，评估梗死面积、心功能与TUNEL；C/EBP-β-KI小鼠验证磷酸化模拟的保护作用。

        7

        ChIP-seq解析C/EBP-β与FoxO1启动子结合

        在体检测C/EBP-β Thr250磷酸化对C/EBP-β与FoxO1启动子结合的影响。

        WT与C/EBP-β-KI小鼠行sham或3 h心肌缺血，ChIP-seq检测Cat、Mnsod等启动子结合峰及motif富集。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        超声心动图血流动力学测定Masson三色染色小麦胚芽凝集素染色TUNEL检测
        验证细胞功能变化
        TUNEL检测CellTiter-Blue细胞活力检测免疫荧光
        验证分子表达变化
        免疫印迹定量RT-PCRRT2 Profiler PCR芯片荧光素酶报告基因实验Phos-tag SDS-PAGE
        验证机制链路
        免疫共沉淀pull-down结合实验体外激酶实验电泳迁移率变动实验双链DNA pull-down实验染色质免疫沉淀染色质免疫沉淀测序质谱分析
        评估体内效果
        心肌缺血/再灌注手术心肌内基因转移Alcian blue与TTC染色
        数据分析与统计
        单因素方差分析Student t检验

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        免疫印迹过氧化氢酶抗体Abcamab16731
        Mst1抗体BD Biosciences611052
        MnSOD抗体BD Biosciences611581
        FoxO1抗体Cell Signaling Technology2880
        磷酸化Mst1（Thr183）抗体Cell Signaling Technology3681
        GAPDH抗体Cell Signaling Technology2118
        组蛋白H3抗体Cell Signaling Technology9715
        PRDX2抗体Cell Signaling Technology46855
        免疫荧光心肌肌钙蛋白T抗体Thermo Fisher ScientificMA5-12960
        Alexa Fluor 488标记抗小鼠IgGThermo Fisher ScientificA-11029
        Alexa Fluor 594标记抗兔IgGThermo Fisher ScientificA-11037
        含DAPI的VECTASHIELD封片剂Vector Laboratories Inc.--
        体外激酶实验重组活性Mst1蛋白Millipore--
        泛素化检测GST串联泛素结合实体2Life Sensors--
        RT2 Profiler PCR array大鼠FoxO1信号通路RT2 Profiler PCR芯片QIAGENCLAR23789
        qPCRRT2 SYBR Green/ROX qPCR预混液Applied Biosystems--
        荧光素酶报告基因实验pGL3-basic载体Promega--
        ChIPSimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒Cell Signaling Technology--
        ChIP-seqTruSeq ChIP文库制备试剂盒Illumina--
        Illumina NextSeq500测序仪Illumina--
        质谱分析Orbitrap Velos串联质谱仪Thermo Scientific--
        Pierce C18离心柱Thermo Scientific--
        H2O2检测Amplex Red过氧化氢检测试剂盒Invitrogen--
        细胞培养Lipofectamine 2000转染试剂Invitrogen--
        siRNA转染Lipofectamine RNAiMAX转染试剂Thermo Fisher Scientific--
        大鼠C/EBPβ siRNAThermo Fisher Scientific4390771
        重组蛋白纯化谷胱甘肽Sepharose 4BGE Healthscience--
        PreScission蛋白酶GE Healthcare--
        核质分离NE-PER核质提取试剂PIERCE--

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        体外激酶实验与磷酸化位点鉴定
        重组活性Mst1用量（10 ng）、FoxO1底物用量（1 μg）、ATP浓度（100或5 μM）、反应温度与时间（30 °C 30 min）
        阅读提示：Methods中In vitro kinase assays小节及Fig. 1d、Fig. 5d图注
        心肌细胞腺病毒转导与处理
        腺病毒转导剂量（10 MOI）、H2O2浓度（10 μM）、检测时间点
        阅读提示：Fig. 1a、Fig. 3a、Fig. 6c图注及Methods中Construction of adenoviruses
        小鼠缺血/再灌注手术
        缺血时间（45 min）、再灌注时间（24 h）、LAD结扎位置、AAR与梗死面积计算方法
        阅读提示：Methods中I/R surgery in vivo与Assessment of area at risk and infarct size小节、Fig. 7a图注
        小鼠持续缺血模型
        缺血持续时间（4 h）、分组（Tg-Mst1、Tg-DN-Mst1、C/EBP-β+/−等）、样本量
        阅读提示：Fig. 6e图注及Results相关段落
        ChIP-seq
        每组小鼠数（3只心脏合并）、缺血时间（3 h）、测序平台与分析流程
        阅读提示：Methods中Chromatin immunoprecipitation sequencing小节、Fig. 7d图注

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