患者数据集分析与LILRB1表达验证
确定LILRB1表达与MM患者预后及侵袭性行为的相关性。
分析Zhan、Carrasco、Broyl、MMRF等MM患者数据集，比较不同预后、分期、复发状态和细胞遗传学风险组中LILRB1表达；通过Western blot和流式细胞术检测MM细胞系和原代患者样本中LILRB1蛋白表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
白细胞免疫球蛋白样受体B1（LILRB1）通过维持胆固醇稳态保护人多发性骨髓瘤细胞免受铁死亡
Leukocyte immunoglobulin-like receptor B1 (LILRB1) protects human multiple myeloma cells from ferroptosis by maintaining cholesterol homeostasis.
实验完整度
高包含患者数据集分析、多种MM细胞系体外实验、原代MM患者样本、NSG小鼠体内模型及机制验证（co-IP、LC-MS/MS、代谢物检测）
主要模型
人MM细胞系ARP-1、MOLP-8、MM.1R等 原代MM患者样本 NSG小鼠尾静脉注射MM细胞模型
重点核对
LILRB1敲低（shRNA #1和#3混合）或过表达后，MM细胞在体外对铁死亡诱导剂（RSL3、FIN56、erastin、AA）的敏感性和脂质过氧化水平 NSG小鼠尾静脉注射2×10^6个 luciferase表达CTR-KD或LILRB1-KD ARP-1（雄性）或MOLP-8（雌性）细胞，监测肿瘤负荷和生存 ferroptosis抑制剂liproxstatin-1（15 mg/kg，腹腔注射，每日）对LILRB1-KD MM-bearing小鼠肿瘤进展的逆转作用 LILRB1与LDLRAP1/LDLR的相互作用通过co-IP（内源和外源表达系统）和免疫荧光共定位验证 LDL/胆固醇摄取通过流式细胞术（pHrodo Red-LDL）、荧光微板读取细胞外/内胆固醇浓度检测
摘要
多发性骨髓瘤（MM）是一种以骨髓中浆细胞不受控制增殖为特征的血液系统恶性肿瘤。侵袭性进展的MM患者生存率低，这凸显了寻找新治疗靶点的迫切需求。在此，我们证明，白细胞免疫球蛋白样受体B1（LILRB1）——一种传导负向免疫应答的跨膜受体——是与MM患者不良预后相关的排名最靠前的基因之一。LILRB1缺失通过增强MM细胞的铁死亡在体内抑制MM进展。机制研究揭示，LILRB1与低密度脂蛋白受体（LDLR）和LDLR衔接蛋白1（LDLRAP1）形成复合物，以促进LDL/胆固醇摄取。LILRB1缺失损害胆固醇摄取，但激活从头胆固醇合成途径以维持细胞胆固醇稳态，导致抗铁死亡代谢物角鲨烯减少。我们的研究揭示了LILRB1在调节胆固醇代谢和保护MM细胞免受铁死亡中的作用，提示LILRB1作为MM患者有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LILRB1在MM进展中的作用及其是否可作为治疗靶点，以及其调控MM细胞铁死亡的机制。
- 核心机制
- LILRB1与LDLR和LDLRAP1形成复合物促进LDL/胆固醇摄取；LILRB1缺失抑制胆固醇摄取，代偿性上调SQLE，减少抗铁死亡代谢物角鲨烯，从而增加MM细胞对铁死亡的敏感性。
- 主要证据
- 患者数据集分析显示LILRB1高表达与不良预后相关；LILRB1敲低在体外增加铁死亡诱导剂引起的脂质过氧化和细胞死亡，在体内抑制MM进展且该抑制可被liproxstatin-1逆转；LILRB1过表达则相反；co-IP和LC-MS/MS证实LILRB1与LDLRAP1/LDLR结合。
- 研究意义
- 揭示LILRB1在维持胆固醇稳态和保护MM细胞免受铁死亡中的作用，提示LILRB1作为MM患者有前景的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LILRB1敲低/过表达对MM体内进展的影响
验证LILRB1在MM体内发展中的作用。
在ARP-1和MOLP-8细胞中敲低LILRB1，在MM.1R细胞中过表达LILRB1，尾静脉注射入NSG小鼠，监测肿瘤负荷、骨髓浸润和生存。
LILRB1缺失对铁死亡敏感性的体外验证
确定LILRB1是否保护MM细胞免受铁死亡。
用铁死亡诱导剂RSL3、FIN56、erastin、AA或谷氨酰胺剥夺处理CTR-KD和LILRB1-KD MM细胞，检测脂质过氧化和细胞死亡；用铁死亡抑制剂Fer-1或DFO验证；在原代MM患者样本中检测LILRB1表达与脂质ROS的关系。
LILRB1相互作用蛋白鉴定与LDL摄取功能验证
鉴定LILRB1在MM细胞中的新型相互作用蛋白并验证其在LDL摄取中的作用。
用抗LILRB1或抗IgG抗体进行co-IP，LC-MS/MS鉴定相互作用蛋白；co-IP验证LILRB1与LDLRAP1和LDLR的结合；免疫荧光检测共定位；流式细胞术和免疫荧光检测LDL摄取；检测细胞外和细胞内胆固醇浓度。
胆固醇代谢重编程与角鲨烯水平分析
探究LILRB1缺失后胆固醇合成途径的变化及对角鲨烯的影响。
Western blot检测SQLE和HMGCR表达；用胆固醇合成途径抑制剂（simvastatin、terbinafine、NB598）处理细胞；HPLC-MS检测角鲨烯水平；ELISA检测CoQ10；13C6-葡萄糖同位素示踪分析角鲨烯和CoQ10合成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 原代MM细胞分离 | Ficoll-Paque PREMIUM密度梯度离心液 | Cytiva | 17544202 |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | MilliporeSigma | R8758 |
| 动物饲养 | Teklad辐照全球无大豆蛋白挤压啮齿动物饲料 | inotivco | 2920X |
| 质谱分析 | Orbitrap Fusion三合一质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| Dionex UltiMate 3000二元RSLCnano系统 | Thermo Scientific | -- | |
| Western blot | 抗FLAG抗体 | Proteintech | 66008-4-Ig; 20543-1-AP |
| 抗LDLR抗体 | Proteintech | 10785-1-AP | |
| 抗LDLRAP1抗体 | Proteintech | 66932-2-Ig | |
| 抗APOB抗体 | Proteintech | 20578-I-AP | |
| 抗APOE抗体 | Proteintech | 66830-I-Ig | |
| 抗HMGCR抗体 | Proteintech | 13533-1-AP | |
| 抗His抗体 | Proteintech | 10001-0-AP; 66005-1-Ig | |
| LILRB1/CD85j兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 78144 | |
| 抗LILRB1抗体 | Abcam | ab238145 | |
| 抗SQLE抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-271651 | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| 抗小鼠二抗 | Cytiva | NA9311ML | |
| 抗兔二抗 | Cytiva | NA9341ML | |
| 免疫共沉淀 | 抗FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 |
| 免疫荧光 | 抗LDLR抗体 | R&D | AF2148 |
| 抗LDLRAP1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-514263 | |
| 驴抗山羊二抗 | Invitrogen | A32849 | |
| 驴抗小鼠二抗 | Invitrogen | A32773 | |
| 驴抗兔二抗 | Invitrogen | A-21206 | |
| 流式细胞术 | APC标记Annexin V | BioLegend | 640941 |
| APC抗人CD85j抗体 | BioLegend | 333720 | |
| APC小鼠IgG2b, κ同型对照抗体 | BioLegend | 400322 | |
| PE抗人CD85j抗体 | BioLegend | 333708 | |
| PE小鼠IgG2b, κ同型对照抗体 | BioLegend | 400314 | |
| APC抗人CD138抗体 | BioLegend | 352308 | |
| PE抗人CD138抗体 | BioLegend | 352306 | |
| PE抗Apo E抗体 | BioLegend | 803405 | |
| MTS检测 | MTS检测试剂盒 | Promega | -- |
| 细胞死亡检测 | 碘化丙啶溶液 | -- | -- |
| HPLC-MS检测角鲨烯 | Thermo Vanquish超高效液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- |
| Fortis SpeedCore PFP色谱柱 | Fortis | -- | |
| Thermo Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 脂质过氧化检测 | BODIPY 665/676脂质过氧化传感器 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| BODIPY 581/591 C11脂质过氧化传感器 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 脂质过氧化（MDA）检测试剂盒 | Abcam | ab233471 | |
| 去蛋白样本制备试剂盒 | Abcam | ab204708 | |
| LDL摄取检测 | pHrodo Red标记LDL | Thermo Fisher Scientific | L34356 |
| 胆固醇浓度检测 | 总胆固醇检测试剂盒 | CELL BIOLABS, INC. | STA-390 |
| CoQ10检测 | 人辅酶Q10 ELISA试剂盒 | Novus | NBP3-21147 |
| Western blot | NuPAGE 4–12% Bis-Tris蛋白凝胶 | Invitrogen | -- |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | -- | |
| Bradford蛋白浓度测定试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞培养 | ANBL-6细胞系 | MilliporeSigma | SCC429 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LILRB1敲低/过表达MM细胞体内模型 | 细胞系（ARP-1、MOLP-8、MM.1R）、注射细胞数（2×10^6）、注射途径（尾静脉）、小鼠性别（ARP-1雄性，MOLP-8/MM.1R雌性）、NSG小鼠周龄（6-8周）、终点指标（后肢瘫痪） 阅读提示：Methods 'MM mouse models'小节及Fig. 2图注 |
| 铁死亡诱导剂处理体外实验 | RSL3浓度（400 nM）和处理时间（脂质过氧化4h，细胞死亡10h）、FIN56浓度（15 µM）和时间（18h/24h）、AA浓度（75 µM）和时间（4h/10h）、erastin浓度（文中未明确说明） 阅读提示：Fig. 3图注及Methods 'Detection of cell death'小节 |
| LDL/胆固醇摄取检测 | 无FBS培养24h、pHrodo Red-LDL稀释比例（1:500）和孵育时间（2h）、LDL浓度梯度（0、15、30、45 µg/ml）、胆固醇浓度梯度（0、5、10、20 µM） 阅读提示：Methods 'LDL uptake assay by labeled LDL and flow cytometry'和'Detection of extracellular and intracellular LDL/cholesterol'小节及Fig. 4、Fig. 5图注 |
| Co-IP与LC-MS/MS鉴定LILRB1相互作用蛋白 | 使用抗体（抗LILRB1或抗IgG）、细胞裂解液来源（ARP-1）、质谱仪器型号和数据分析参数（FDR 1% strict/5% relaxed） 阅读提示：Methods 'Mass spectrum analysis'小节及Fig. 4图注 |
| 角鲨烯和CoQ10检测 | HPLC-MS色谱柱（Fortis SpeedCore PFP）、流动相、流速（300 mL/min）、质谱监测离子（squalene 411.3985 m/z, squalene-d6 417.4362 m/z）、同位素示踪13C6-葡萄糖孵育24h 阅读提示：Methods 'Analysis of squalene by HPLC-MS'和'Analysis of Squalene and CoQ10 by UHPLC-HRMS'小节及Fig. 7图注 |